Ответы на вопросы об особенностях работы с FFPE образцами тканей

Секвенирование следующего поколения (NGS) позволяет качественно анализировать короткие нуклеотидные последовательности, что делает его мощным инструментом для работы с образцами нуклеиновых кислот, выделенных из тканей, фиксированных в формалине и заключенных в парафиновые блоки (FFPE).

В данном разделе приведены ответы на 10 самых часто задаваемых вопросов об особенностях подготовки FFPE-образцов к NGS. (Составил старший научный сотрудник по прикладным вопросам Jung Doh.)

1. В каких случаях для NGS приходится использовать FFPE-образцы тканей, а не свежезамороженные образцы?

Свежие и быстрозамороженные образцы – богатый источник ДНК. Но собирать и хранить такие образцы дорого, поэтому делают это не так часто. Соответственно их невозможно использовать в крупномасштабных ретроспективных исследованиях опухолей, которые, в конечном итоге, могут привести к разработке новых методов лечения рака.

В противоположность этому, на постоянной основе в ходе лечения и ухода за пациентами пополняются архивы образцов тканей, фиксированных в формалине и заключенных в парафиновые блоки (FFPE). По некоторым оценкам в больницах и банках тканей по всему миру хранится от 400 млн.1 до более 1 млрд.2 FFPE-образцов. Многие из них сопровождаются клиническими комментариями о первичном диагнозе, схеме лечения, реакциях на лекарства, повторных проявлениях, и их можно связать с клиническими результатами и отдаленными наблюдениями.3

Для некоторых типов опухолевых тканей FFPE-образцы часто являются единственным источником ДНК4. И только они могут предоставить исследователям важную информацию о некоторых редчайших раковых заболеваниях и других состояниях5.

2. Сравнимо ли качество результатов NGS-секвенирования FFPE-образцов и свежезамороженных образцов?

Да, по информации в большинстве последних литературных источников качество сравнимо. По сути, возможность анализировать с помощью NGS большое количество коротких последовательностей делает его идеальной технологией секвенирования фрагментов нуклеиновых кислот, выделяемым из FFPE-образцов6.

Например, в одном из недавних исследований авторы выполнили полноэкзомное секвенирование (WES - whole exome sequencing) ДНК гастроинтестинальной стромальной опухоли, выделенной из свежезамороженных (FF - fresh-frozen) или FFPE-образцов. Сохранность FFPE-ДНК оценивали модифицированным методом RAPD-ПЦР и в результате разделили образцы на два типа: высококачественные (HQhigh-quality) и низкокачественные (LQ - low-quality). Для обоих типов FFPE-образцов удалось подготовить библиотеку ДНК и выполнить обогащение экзомными участками, хотя в случае LQ-FFPE-образцов выход и размер вставок был несколько ниже. Качество данных, полученных в результате WES FF- и FFPE-образцов было одинаковым. Количество данных для HQ-FFPE-образцов оказалось сравнимо с количеством данных для FF-образцов7.

В других исследованиях6, 8, 9, 10 выявили строгую корреляцию между результатами секвенирования FF- и FFPE-образцов, что подтверждает возможность создания высококачественных библиотек для NGS и получения высококачественных результатов даже из LQ-FFPE-образцов опухолевых тканей11.

3. Влияет ли процесс фиксации тканей формалином и заключения их в парафиновые блоки на выход и качество выделяемой из них в последствии ДНК?

Это возможно. Конечно об этом не задумывались 120 лет назад, когда обнаружили, что формальдегид (главный компонент формалина) – превосходный фиксатор для сохранения образцов тканей12. Патологи и гистологи фиксировали ткани формалином более века, и только в начале 1970-х годов исследователи выяснили, что формалин создает сшивки между внутриклеточными макромолекулами, такими как белки и ДНК14.

Фрагментация – это другой тип повреждения ДНК, индуцируемый фиксацией формалином. Она может снижать количество ДНК, подходящей для амплификации методом ПЦР. Исследователи полагают, что долговременное хранение FFPE-образцов также может способствовать фрагментации из-за воздействия факторов окружающей среды16, 17.

Тем не менее многочисленные исследования подтверждают возможность использования FFPE-ДНК для стандартных ПЦР-технологий и NGS5, 18, 19. И хотя фрагментация может быть скорость-лимитирующем фактором в методах, требующих длинные ампликоны, исследователи успешно использовали и более короткие ампликоны, полученные из фрагментированной FFPE-ДНК.

Кроме того, было показано, что некоторые модификации, индуцированные формалином, могут быть частично обратимы. И этап восстановления теперь включен во многие протоколы наборов для выделения нуклеиновых кислот из FFPE-материалов10. Конкретный пример: в некоторых исследованиях сообщается о более высокой частоте дефектов последовательности при секвенировании FFPE-образов (в основном из-за замены нуклеотидов C:G>T:A)9, 22, 23, 24, при этом в других исследованиях не удалось собрать большого количества доказательств дефектов5, 25. Так или иначе дефекты последовательности типа C:G>T:A в основном вызваны повреждениями урацила, и обработка перед ПЦР FFPE-ДНК урацил-ДНК гликозилазой существенно сокращает количество таких дефектов, не вызывая истинных мутационных изменений последовательности4.

Другой важный момент. Процесс подготовки FFPE-блоков, включающий длительное хранение при комнатной температуре, может вызывать мутации ДНК, и в результатах секвенирования могут встречаться ложные однонуклеотидные вариации (SNV) или инсерции/делеции. Однако подобные повреждения будут распределены по всем ДНК-фрагментам случайным образом и смогут быть скорректированы благодаря большой глубине секвенирования. Поэтому по рекомендациям исследователей при анализе FFPE-материалов глубина покрытия должна быть, по меньшей мере, 80-кратной.

Наконец, метод депарафинизации также может влиять на возможность амплифицирования выделяемой ДНК26. Чем выше температура плавления, тем больше вероятность денатурации двуцепоченой ДНК. Но при слишком низкой температуре парафин не расплавится полностью, что снизит выход нуклеиновых кислот. Для разных FFPE-образцов могут потребоваться различные температура и время плавления. Важно добиться приемлемого баланса между температурой плавления, качеством ДНК и выходом ДНК. Рекомендуемая максимальная температура составляет 90°C. Плавление при более высоких температурах может привести к тому, что значительная фракция ДНК будет одноцепочечной. Некоторые исследователи считают, что нагревания при 75°C в течение 5 мин вполне достаточно для того, чтобы расплавить парафин и сохранить ДНК в двуцепочечном виде5.

4. Влияет ли срок хранения FFPE-образцов на возможность подготовки из них библиотеки для секвенирования?

В общем случае не влияет, но успех может зависеть о того, как изначально были зафиксированы образцы, в каких условиях они хранились и каким методом подготавливаются библиотеки. В одном из недавних исследований из 94% образцов со сроком хранения до 3-х лет удавалось получать библиотеки, пригодные для секвенирования. Для более старых образцов (14-21 год) вероятность успеха была ниже – 50%27. Другие исследователи не обнаружили существенной разницы между макромолекулами, выделенными из блоков, хранившихся 11-12 лет, 5-7 лет или 1-2 лет, при сравнении с блоками, хранившимися меньше года28. А в одной работе сообщалось об успешной подготовке библиотеки из РНК, выделенной из 20-летнего образца FFPE-ткани6.

5. Можно ли на самом деле ожидать приемлемого качества секвенирования 10-20-летних FFPE-образцов?

По одному из сообщений происходит ничтожно малое снижение качества секвенирования FFPE-образцов, хранившихся более 10 лет29. Это доказывает и более раннее исследование 14- и 18-летних FFPE-образцов25. Некоторые специалисты считают, что NGS-технология позволяет проводить молекулярный анализ ДНК и РНК из FFPE-образцов, которые хранились даже 20 лет6. В любом случае показано, что для определенных целей можно успешно выполнять молекулярный анализ нуклеиновых кислот, выделенных из FFPE-тканей, хранившихся более 40 лет30.

6. Может ли качество ДНК, выделенной из FFPE-образцов, влиять на последующее выполнение геномных приложений?

Может, и еще более важен вопрос – насколько сильно. Исследователи давно знают, что фиксация формалином влияет на последующие геномные приложения из-за того, что возникают сшивки ДНК с ДНК и белками, которые могут останавливать полимеразы. Кроме того, сшивки ДНК-ДНК могут ингибировать денатурацию31. Озабоченность качеством FFPE-ДНК в значительной мере связана с возможностью ее применения для скрининга мутаций. Поскольку такие аспекты вопроса, как дефекты последовательности, ложно отрицательные варианты и оптимальный алгоритм выбора нуклеотида исследованы еще недостаточно, то их влияние на секвенирование остается неясным.

Зато совершенно ясно, что деградация ДНК и дефекты последовательности осложняют детекцию мутаций, поскольку могут быть ошибочно за них приняты. И хотя проблему деградации можно решить, используя более короткие ПЦР-ампликоны, решение проблемы дефектов последовательности, помимо обработки FFPE-ДНК урацил-ДНК гликозилазой перед ПЦР, еще предстоит найти4.

Однако, несмотря на существующие трудности, многие исследователи успешно использовали FFPE-ДНК для анализа числа копий и детекции мутаций как путем направленного секвенирования одиночных генов33, 34, так и путем полноэкзомного5, 35 и полногеномного25 секвенирования. Также были высказаны предположения, что в исследованиях экспрессии генов можно успешно использовать FFPE-образцы вместо свежезамороженных образцов.

7. Какое количество FFPE-ДНК требуется для успешного NGS?

Ответ на этот вопрос в значительной мере зависит от того, какой тип данных вы хотите получить. Согласно одному из сообщений, для адекватного покрытия экзома необходимо не меньше 250 нг FFPE-ДНК. Авторы же другого недавнего исследования 99 FFPE-образцов утверждают, что для «успешного» секвенирования экзома достаточно 16 нг FFPE-ДНК36. В нескольких работах секвенирование проводили всего с 10 нг образцов, хотя успех в таком случае ограничивался только анализом числа копий37. В этом последнем исследовании37 авторы подготовили библиотеку фрагментов, используя всего 5 нг FFPE-ДНК, и полученная в итоге кариограмма числа копий была неотличима от кариограммы, полученной с использованием 1 мг ДНК.

Большинство исследователей соглашается с тем, что возможность успешного секвенирования FFPE-ДНК объясняется способностью метода NGS извлекать полезные данные, в том числе об однонуклеотидных заменах, инсерциях/делециях и транслокациях, из относительно коротких фрагментов ДНК этого типа29, 38.

8. Можно ли успешно выделять РНК и/или микроРНК из FFPE-образцов?

Да. Однако секвенирование РНК из FFPE-образцов может быть достаточно трудным, поскольку РНК менее устойчива, чем ДНК. FFPE-РНК может быть деградирована в большей степени, чем РНК из других источников. Однако показано, что из FFPE-материалов возможно получить образцы для высококачественного секвенирования с целью составления профиля микроРНК39. Из-за малых размеров микроРНК меньше подвержена деградации и модификации. Результаты ее анализа будут больше отражать происходящее в свежих тканях, нежели результаты анализа мРНК.

В одном из исследований подготовили 272 образца РНК, выделив их из тканей 17 типов и 65 FFPE-блоков. Результаты показали, что микроРНК – не только подходящий, но и, по всей видимости, лучший аналит для молекулярной характеризации поврежденных архивных клинических материалов40. Если целью исследования является обнаружение новых микроРНК, то лучшим методом будет NGS, поскольку оно предоставляет наибольшее количество данных и не требует знания последовательностей, которые нужно обнаружить39.

9. Можно ли использовать FFPE-ткани для обнаружения ДНК вирусов, ставших причиной болезни в прошлом?

Этот вопрос пока что остается открытым. Разработаны новые методики детекции известных вирусных нуклеотидных последовательностей в образцах FFPE-тканей, которые к настоящему времени использовали для исследования вируса гриппа A/H1N1, ставшего причиной эпидемии испанки в 1918 году. Используя РНК, выделенную из FFPE-образца легочной ткани жертвы этой знаменитой пандемии, удалось охарактеризовать вирус и затем восстановить его методами реверсивной генетики41. Остается неясным, можно ли, как и в случае известных вирусов, применять сиквенс-независимую амплификацию и NGS для детекции неизвестных вирусов42, 43, 44.

10. Можно ли считать одинаково надежными разные биоинформационные инструменты для анализа результатов NGS FFPE-образцов?

Не совсем. Хотя многие исследователи возлагают большие надежды на технологию секвенирования третьего поколения, до сих пор нет общепризнанных стандартных методов анализа данных NGS45 и контроля качества результатов секвенирования46. Для анализа NGS-данных было разработано множество биоинформационных инструментов, но их воспроизводимость все еще нуждается в доработке47.

На данный момент все коммерчески доступные NGS-платформы характеризуются различными типами/вероятностью ошибок. Пользователи должны тщательно оценивать и устранять все ошибки, чтобы минимизировать их влияние на последующий анализ данных. Также важен выбор биоинформационной стратегии. Поэтому пользователи должны понимать принципы работы, преимущества и ограничения используемых инструментов, чтобы результаты были максимально достоверными46.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Sah S, Chen L, Houghton J, et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med 2013;5:77. 
2 Blow N. Tissue preparation: tissue issues. Nature 2007;448:959–63. 
3 Li P, Conley A, Zhang H, et al. Whole-Transcriptome profiling of formalin-fixed, paraffin-embedded renal cell carcinoma by RNA-seq. BMC Genomics 2014;15:1087. 
4 Do H, Dobrovic A. Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil- DNA glycosylase. Oncotarget 2012;3:546–558. 
5 Kerick M, Isau M, Timmermann B, et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med Genomics 2011;4:68. 
6 Hedegaard J, Thorsen K, Lund MK, et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One 2014;9:e98187. 
7 Astolfi A, Urbini M, Indio V, et al. Whole exome sequencing (WES) on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue in gastrointestinal stromal tumors (GIST). BMC Genomics 2015;16:892. 
8 Graw S, Meier R, Minn K, et al. Robust gene expression and mutation analyses of RNA-sequencing of formalin-fixed diagnostic tumor samples. Sci Rep 2015;5:12335. 
9 Spencer DH, Sehn JK, Abel HJ, et al. Comparison of clinical targeted next-generation sequence data from formalin-fixed and fresh-frozen tissue specimens. J Mol Diagn 2013;15:623–633. 
10 Norton N, Sun Z, Asmann YW, et al. Gene expression, single nucleotide variant and fusion transcript discovery in archival material from breast tumors. PLoS One 2013;8:e81925. 
11 Munchel S, Koestler DC, Bibikova M. Targeted or whole genome sequencing of formalin fixed tissue samples: Potential applications in cancer genomics. Oncotarget 2015;6(28):25943–61. 
12 Blum F: Der Formaldehyde als Hartungsmittel. Z wiss Mikr 1893;10:314. 
13 Dove A. Hard-core sequencing. Science/AAAS Custom Publishing Office. 2016. Available from: URL: http://www.sciencemag.org/custom-publishing/technology-features/hard-core-sequencing. 
14 Feldman MY. Reactions of nucleic acids and nucleoproteins with formaldehyde. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1973;13:1– 49. 
15 Sikorsky JA, Primerano DA, Fenger TW, et al. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochem Biophys Res Commun 2007;355(2):431–437. 
16 Bruskov VI, Malakhova LV, Masalimov ZK, et al. Heat-induced formation of reactive oxygen species and 8-oxoguanine, a biomarker of damage to DNA. Nucleic Acids Res 2002;30(6):1354–1363. 
17 Pfeifer GP, You YH, Besaratinia A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res 2005;571(1–2):19–31. 
18 Wagle N, Berger MF, Davis MJ, et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov 2012;2:82–93. 
19 Yost SE, Smith EN, Schwab RB, et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res 2012;40(14):e107. 
20 Wong SQ, Li J, Tan AY, et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel
21 Masuda N, Ohnishi T, Kawamoto S, et al. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res 1999;27:4436-4443. 
22 Do H, Wong SQ, Li J, Dobrovic A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem 2013;59:1376 – 83. 
23 Anaka M, Hudson C, Lo PH, et al. Intratumoral genetic heterogeneity in metastatic melanoma is accompanied by variation in malignant behaviors. BMC Med Genomics 2013;6:40. 
24 Do H, Dobrovic A. Limited copy number-high resolution melting (LCN-HRM) enables the detection and identification by sequencing of low level mutations in cancer biopsies. Molec Cancer 2009;8:82. 
25 Schweiger MR, Kerick M, Timmermann B, et al. Genome-wide massively parallel sequencing of formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues for copy-number- and mutation-analysis. PLoS ONE 2009;4:e5548. 
26 Sengüven B, Baris E, Oygur T, et al. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. Int J Med Sci 2014;11(5):494-99. 
27 Bolognesi C, Forcato C, Buson G, et al. Digital Sorting of Pure Cell Populations Enables Unambiguous Genetic Analysis of Heterogeneous Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumors by Next Generation Sequencing. Sci Rep 2016;6:20944. 
28 Kokkat TJ, Patel MS, McGarvey D, et al. Archived formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) blocks: A valuable underexploited resource for extraction of DNA, RNA, and protein. Biopreserv and Biobank 2013;11(2):101–06. 
29 Corless CL, Spellman PT. Tackling formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue with next-generation sequencing. Cancer Discov 2012;2:23–24. 
30 Ludyga N, Grünwald B, Azimzadeh O, et al., Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch 2012;460(2):131-40. 
31 Gilbert MT, Haselkorn T, Bunce M, et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when? PLoS One 2007;2(6):e537. 
32 Wang M, Escudero-Ibarz L, Moody S, et al. Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues by Fluidigm Multiplex PCR and Illumina Sequencing. J Mol Diagn 2015;17:521e532. 
33 Ausch C, Buxhofer-Ausch V, Oberkanins C, et al. Sensitive detection of KRAS mutations in archived formalin-fixed paraffin-embedded tissue using mutant-enriched PCR and reverse-hybridization. J Mol Diagn 2009;11:508–513. 
34 Solassol J, Ramos J, Crapez E, et al. KRAS Mutation Detection in Paired Frozen and Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Colorectal Cancer Tissues. Internat J Mol Sci 2011;12:3191–3204. 
35 Beltran H, Yelensky R, Frampton GM, et al. Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity. Eur Urol 2013;63:920–26. 
36 Van Allen EM, Wagle N, Stojanov P, et al. Whole-exome sequencing and clinical interpretation of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor samples to guide precision cancer medicine. Nat Med 2014;20:682–8. 
37 Wood HM, Belvedere O, Conway C, et al. Using next-generation sequencing for high resolution multiplex analysis of copy number variation from nanogram quantities of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. Nucleic Acids Res 2010;38:e151. 
38 Duncavage EJ, Magrini V, Becker N, et al. Hybrid capture and next-generation sequencing identify viral integration sites from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Mol Diagn 2011;13:325-33. 
39 Chatterjee A, Leichter AL, Fan V, et al. A cross comparison of technologies for the detection of microRNAs in clinical FFPE samples of hepatoblastoma patients. Sci Rep 2015;5:10438. 
40 Doleshal M, Magotra AA, Choudhury B, et al. Evaluation and validation of total RNA extraction methods for microRNA expression analyses in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn 2008;10(3):203–11. 
41 Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, et al. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science 2005;310:77–80. 
42 van den Brand JM, van Leeuwen M, Schapendonk CM, et al. Metagenomic analysis of the viral flora of pine marten and European badger feces. J Virol 2012;86:2360–65. 
43 Bodewes R, van de Bildt MW, Schapendonk CM, et al. Identification and characterization of a novel adenovirus in the cloacal bursa of gulls. Virology 2013a;440:84–88. 
44 Bodewes R, van Run P, Schürch AC, et al. Virus characterization and discovery in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J Virol Meth 2015;214:54–59.