Исторические предпосылки проточной цитометрии (1850 - 1953)

До 1850-х гг.

Были доступны только натуральные красители, например, шафран. Именного его использовал Левенгук для окраски мышечных клеток.

1880-е гг. – Пауль Эрлих

По степени окраски лейкоцитов кислотными и основными красителями Эрлих разделил их на эозинофилы, базофилы и нейтрофилы.

1904 – Август Кёлер

Флуоресцентный УФ-микроскоп.

Ранние 1900-е гг. – Паппенгейм и Унна

Использовали метиловый зеленый и пиронин для окраски ядер клеток зеленым цветом, а цитоплазмы – красным.

1925 – Роберт Фёльген

Установил, что ДНК содержится в ядрах и животных, и растительных клеток. Разработал процедуру стехеометрического окрашивания ДНК с помощью дериватизирующего реактива Шиффа (фуксинсернистая кислота).

1934 – Эндрю Молдаван

Под давлением направлял поток суспендированных в воде клеток крови через стеклянную капиллярную трубку. Пытался регистрировать каждую клетку с помощью фотоэлектрического аппарата.¹

(1938-1998) – Торбьорн Касперссон, окрашивание нуклеиновых кислот

1941 – Продемонстрировал, что «нуклеиновые кислоты являются отнюдь не отходами жизнедеятельности, а необходимыми компонентами синтеза белка в клетке и активно участвуют в этом процессе.»²

1950 – Показал, что содержание и ДНК, и РНК в активно растущих клетках повышено. В известной монографии от 1950 года «Cell Growth and Cell Function"³ описал метаболизм нуклеиновых кислот и белков при нормальном и аномальном клеточном росте. В этих исследованиях он использовал в качестве УФ-источника искровой разряд кадмия, а для детекции сигналов – примитивные электронные цепи. Ядра клеток окрашивал по Фёльгену.

1941 – А.Х. Кунс, Х.Д. Крич и Р.Н. Джонс

Разработали методику окраски флуоресцентно меченными антителами. Он метили антипневмококковые антитела антраценом, что позволяло им по голубой флуоресценции, возбужденной УФ-светом, детектировать и клетки организма, и антитела в тканях.⁴

1950 – А.Х. Кунс и М.Х. Каплан

Конъюгировали флуоресцеин с изоцианатом. Окраска таким красителем давала лучший зелено-голубой флуоресцентный сигнал, более далекий от спектра собственной флуоресценции ткани. Метод включал опасные этапы подготовки с использованием фосгена.⁵

История клеточной клинической диагностики

1943 – Выдающаяся монография анатома Г.Г. Папаниколау и гинеколога Г.Ф. Траута «Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear».⁶

Успех теста Папаниколау (PAP)

1941 – По сообщениям Папаниколау и Траута в США за год от рака шейки матки умирает около 26 000 женщин.

1996 – При двукратном росте населения США смертность от рака шейки матки сократилась до 4 900 женщин в год. Как минимум, половина из них никогда не делала PAP-теста.

Усовершенствование PAP-теста

1951 – Специально для исследований PAP-мазков лаборатория Airborne instruments (Минеола, Нью-Йорк, США) создает клеточный анализатор Cytoanalyzer на основе технологий, разработанных во Вторую мировую войну.

1980-е гг. - Проекты по компьютеризации и автоматизации клеточного анализа TICAS и CYBEST. (Оказались непригодными для всеобщего пользования.)

1944 – Освальд Т. Эвери

Установил, что ДНК является носителем генетической информации.

1947 – Фрэнк Т. Гукер

• Разработал проточный цитометр для детекции бактерий в аэрозолях.
• Статья опубликована в 1947 году⁷ (работа была выполнена во время Второй мировой войны и засекречена).
• Цель: быстрая идентификация аэрозольных бактерий и спор после использования биологического оружия
• Детекция: Поток фильтрованного воздуха движется через проточную камеру, освещенную по принципу темного поля. Источник света – автомобильная фара (Форд). Первое использование фотоэлектронного умножителя.

1948 – Первый счетчик клеток

1951 – Первый микрокфлуорометрический сканнер

Р.К. Меллорс и Р. Сильвер разработали микрокфлуорометрический сканнер для дифференциальной детекции клеток.⁸

1953 – Патент на двухцветный счетчик клеток⁹

1953 - П.Д. Кросланд-Тэйлор¹⁰

Разработал концепцию гидродинамической фокусировки и прибор для подсчета клеток в потоке жидкости, протекающей по трубке.

1953 – Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик

Это фотография части оригинальной модели, созданной Уотсоном и Криком в Кэмбриджском университете в 1953 году. Работа, начавшаяся с открытия Эвери того, что ДНК является трансформирующим фактором для бактериальных клеток, привела к исследованиям, опровергнувшим старые представления о ДНК, как о повторяющейся простой молекуле, и подтвердившим ее роль в наследовании. И, наконец, в статье от 1953 года Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик описали ее структуру.¹¹

Подсчет клеток крови до автоматизации

• Гемоцитометр был стандартным средством подсчета клеток крови до 1950-х гг.
• Размеры измерительной камеры составляли 3 х 3 х 0,1 мм. Для подсчета эритроцитов (1 x 106 мм-3) кровь разводили в 200 раз.
• Лейкоциты (5 x 103 мм-3) разводили в 10 раз в лизирующем реагенте и красителе, окрашивающем ядра.
• Статистическую изменчивость рассчитывали следующим образом:
• Стандартное отклонение (SD) счета для n элементов определяли как n1/2
• Учитывая, что вручную обычно возможно подсчитать не более 500 клеток, то SD в этом случае равно 22
• Коэффициент вариации (CV) будет равен 22/500 или 4,4%
• Если учесть погрешности дозирования и разведения, то CV достигает  ̴10%

Список литературы

1. Moldavan A. Photo-electric technique for the counting of microscopical cells. Science. 1934 Aug 24;80(2069):188-9.
2. Caspersson T. Studien über den Eiweissumsatz der Zelle. Naturwissenschaften. 1941 29:33.
3. Caspersson T. Cell growth and cell function. A cytochemical study. W. W. Norton & Company, Inc., New York, 1950, 185 pp.
4. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 1941. 47:200–202.
5. Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950 Jan 1;91(1):1-13.
6. Papanicolaou GN and Traut HF. Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear. New York: Commonwealth Fund, 1943.
7. Gucker FT Jr, O'Konski CT, et al. A photoelectronic counter for colloidal particles. J Am Chem Soc. 1947 Oct;69(10):2422-31.
8. Mellors RC, Silver R. A micro-fluorometric scanner for the differential detection of cells; application of exfoliative cytology. Science. 1951 Oct 5;114(2962):356-60.
9. Parker JC, Horst WR, US Patent 2,875,666.
10. Crosland-Taylor P.J. A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature. 1953 Jan 3;171(4340):37-8.
11. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 1953 Apr 25;171(4356):737-8.