Принцип Культера (1954 – 1955)

Будучи в конце 40-х годов XX века служащим Военно-морского флота США, Уоллес Г. Культер разработал импедансометрический метод определения количества и размера частиц. Главным образом, он был предназначен для быстрого подсчета клеток крови путем измерения изменения электропроводности их суспензии в проводящей жидкости, проходящей через отверстие малого диаметра.

В настоящее время этот метод, известный под названием «Принцип Культера», лежит в основе более 98% автоматических счетчиков клеток. За последние 75 лет он был использован для характеризации нескольких тысяч различных промышленных материалов, состоящих из частиц. Упоминания этого метода встречаются более, чем в 8 000 публикациях.

Выпускаемые компанией Beckman Coulter приборы, в основе работы которых лежит принцип Культера, называются счетчиками Культера. С их помощью можно проанализировать лекарственные средства, пигменты, наполнители, тонеры, пищевые продукты, абразивы, взрывчатые вещества, глинистые материалы, минеральные вещества, строительные материалы, материалы для покрытий, металлы, фильтрующие материалы, а также образцы многих других типов. Этот метод подходит для характеризации любого материала, который состоит из частиц и может быть суспендирован в растворе электролита. Счетчики Культера позволяют легко измерять как мелкие частицы диаметром до 0,2 мкм, так и крупные частицы - до 1 600 мкм.

Одним из элементов счетчика Культера является трубка, погруженная в емкость, которая содержит исследуемые частицы, суспендированные в разбавленном растворе электролита. В ее стенке есть отверстие маленького диаметра – апертура (поэтому технологию также называют «апертурной»). Внутри трубки и снаружи нее (но внутри емкости) расположены два электрода. При приложении электрического поля через электролит между электродами протекает электрический ток.

Принцип устройства счетчика Культера

Принцип устройства счетчика Культера

В пространстве апертуры возникает так называемая “чувствительная зона”, проходя через которую каждая частица вытесняет определенное количество электролита. Это приводит к импульсному возрастанию сопротивления, и, как следствие, к небольшому изменению величины электрического тока, которое можно измерить. Высота импульса пропорциональна объему проходящей частицы. Если плотность всех частиц одинакова, то высота импульса также пропорциональна массе частиц.

С помощью анализаторов счета и высоты импульсов можно определить число и объем каждой частицы, проходящей через апертуру. Если точно дозировать и измерять количество жидкости, пропускаемой через апертуру, то можно вычислить концентрацию частиц в образце.

В современных счетчиках Культера Multisizer™3 и Multisizer™4e импульсы оцифровываются, и сохраняются такие их ключевые параметры, как высота, ширина, площадь, метки времени и т.д. Эти характеристики помогают инструменту лучше отличать шум от реальных импульсов, а также нормальные импульсы от искаженных по разным причинам во время прохождения частицы через апертуру.

Сохраненные данные об импульсах можно использовать для мониторинга изменений, происходящих в образце с течением времени, если известна хронология этих импульсов. Объем частицы, как правило, выражен в единицах диаметра эквивалентной сферической частицы, значения которого могут быть использованы для определения распределения частиц по размеру.

Скорость измерений счетчиков Культера достигает 10 000 событий в секунду, поэтому они занимают, как правило, менее 1 минуты.

Диаметры используемых в приборе апертур лежат в диапазоне 10-2 000 мкм. С их помощью можно проанализировать частицы с размерами от 2 до 80% от номинального диаметра апертуры с погрешностью менее 1%. Таким образом, возможно измерение частиц с размерами от 0,2 мкм до 1600 мкм. Например, при помощи апертуры с диаметром 30 мкм можно проанализировать суспензию частиц с размерами от 0,6 мкм до 18 мкм. Апертура с диаметром 140 мкм дает возможность измерить частицы с размерами 2,8 – 84 мкм. Соответственно, чтобы выбрать для анализа оптимальную апертуру нужно учитывать диапазон размеров измеряемых частиц.

Однако следует помнить, что технология позволяет анализировать только те частицы, которые можно суспендировать в растворе электролита. Поэтому, например, для песка верхним пределом измерения будет размер 500 мкм, а для частиц карбида вольфрама – 75 мкм.

Нижний же предел измерений обусловлен электронным шумом, самопроизвольно генерируемым в апертуре. Если образец содержит частицы, размеры которых не могут быть измерены при помощи одной апертуры, прибор позволяет провести анализ при помощи двух и более апертур. Полученные результаты можно наложить друг на друга для определения полного распределения частиц по размеру.

Высочайшая разрешающая способность для определения размера частиц

Во время измерений методом Культера жидкость отсасывается насосом из трубки, и в нее через апертуру устремляются частицы из емкости с образцом. Проходя через чувствительную зону, каждая частица вытесняет объем электролита, равный объему этой частицы. При этом в апертуре возникает резкий скачок сопротивления. Это изменение сопротивления можно зафиксировать как импульс напряжения или тока.

Количество измеренных счетчиком импульсов соответствует числу частиц, а амплитуда импульсов пропорциональна их объему. Прибор обладает высочайшей разрешающей способностью, которую в принципе могут иметь инструменты для характеризации частиц, поскольку он измеряет параметры каждой отдельной частицы. Разрешение для диаметра зависит от измерений напряжения или силы тока, которые при использовании современных технологий могут быть очень точными. Распределение амплитуд может быть определено с точностью до одной частицы.

Самым очевидным преимуществом такого высокого разрешения является возможность детального анализа распределения частиц по размерам. Обычно каждое такое распределение, как в кумулятивной, так и в дифференциальной форме, состоит из нескольких сотен элементов данных (интервалов) в заранее выбранном диапазоне размеров. Каждому интервалу соответствует количество частиц данного размер. Задавая более узкие интервалы, можно построить распределение в более крупном масштабе и рассмотреть его более детально.

Другими преимуществами высокого разрешения  являются тонкая дифференцировка частиц по размерам и более точный статистический анализ распределения. На рисунках показаны результаты измерений с помощью счетчика Multisizer 4 компании Beckman Coulter одного образца в виде двух гистограмм с разным масштабом. Одни и те же данные были разбиты на интервалы разной ширины. Гистограмма слева соответствует более узким интервалам, поэтому она более детально иллюстрирует распределение.

Гистограмма распределения частиц по размерам

Процессор цифровых импульсов

В инструментах, работающих по принципу Культера, изменения электрического сопротивления, возникающие из-за прохождения частиц через апертуру, определяются при помощи быстрых электронных схем. Регистрируемые сигналы тут же со скоростью несколько миллионов раз в секунду оцифровываются. Затем цифровой сигнал, соответствующий каждому импульсу, сохраняется в виде набора характеристик импульса (например, высота, ширина, хронометраж и т.д.). Поскольку целью большинства измерений является определение количества частиц и распределения по размеру, то высота импульса с помощью калибровочной константы переводится в размер частицы и попадает в один из заранее выбранных интервалов. Распределение частиц по размерам и общее количество частиц определяют по окончании измерения всех импульсов.

Все полученные параметры импульсов можно использовать не только с целью построения стандартных полнодиапазонных распределений по размеру. Их можно вычленять или сортировать (т.е. обрабатывать разными способами в зависимости от приложения). Например, если оператор хочет увеличить масштаб распределения и показать его более детально, то ему следует выбрать более узкий диапазон размеров и рассортировать все импульсы по новому набору более узких интервалов. А иногда бывает необходимо провести сортировку высоты импульсов (т.е. размеров) в разные временные интервалы. Подобные графики используются для мониторинга изменений в образце, происходивших во время измерений. Наконец, соотношение высоты и ширины одного и того же импульса могут дать представление о форме частицы.

В качестве частиц в исследуемом образце могут выступать клетки. Проходя через апертуру, они также увеличивают сопротивление. Чем больше клетка, тем больше скачок сопротивления и напряжения. Высота скачка напряжения прямо пропорциональна размеру клетки. Работа всех современных гематологических анализаторов в той или иной степени основана на принципе Культера.

Братья Уолллес и Джозеф Культеры

Уолллес и Джозеф Культеры

Высокоскоростной автоматический счетчик клеток крови и анализатор размеров

Высокоскоростной автоматический счетчик клеток крови и анализатор размеров

Историческая иллюстраци первого счетчика Культера

Историческая иллюстрация первого счетчика Культера

Первая коммерческая модель счетчика Культера

Первая коммерческая модель счетчика Культера

Рукописные черновики рекламных объявлений о первом счетчике Культера

Рукописные черновики рекламных объявлений о первом счетчике Культера

Счетчик Культера Model F

Coulter Counter Model F

Счетчик Культера Model F

На этой модели счетчика Культера был разработан метод подсчета эритроцитов коз. По сравнению с человеком у коз этих клеток больше, и они мельче. С помощью 100- и 70-микронных апертур исследовали образцы крови 25 животных. Также количество эритроцитов в каждом образце определили визуальным методом. Далее выполнили статистическую обработку результатов, чтобы определить, какая апертура дала более точные и воспроизводимые результаты в сравнении с ручным подсчетом. Оказалось, что отличия данных, полученных с помощью апертуры 100 мкм, от данных ручного подсчета, не имели статистической значимости.

Эта технология достигла коммерческого успеха в области медицины, совершив революцию в гематологии. Эритроциты, лейкоциты и тромбоциты составляют большинство форменных элементов крови. Если цельную антикоагулированную кровь человека развести изотоническим раствором, то принцип Культера можно использовать для определения количества и размеров различных клеток в ее составе. Счетчик Культера Model A, разработанный братьями Уоллесом и Джозефом Культерами и вышедший в продажу в 1954 году, стал первым коммерческим прибором подобного типа, предназначенным для гематологических приложений.

Уже через декаду буквально каждая больничная лаборатории США владела счетчиком Культера. И до сих пор работа всех современных гематологических анализаторов в том или иной степени основана на принципе Культера.

Портфолио инструментов Beckman Coulter

Компания Beckman Coulter предлагает широкий выбор инструментов для всесторонней оптимизации работы вашей лаборатории. Ориентированность на инновации, надежность и эффективность позволила нам стать лучшим партнером для клиентов из клинических, научно-исследовательских и промышленных отраслей по всему миру.

Центрифуги

Ассортимент инструментов для центрифугирования Beckman Coulter представлен настольными центрифугами (линейка Microfuge и др.) несколькими моделями высокоскоростных центрифуг, напольными ультрацентрифугами и инструментами для аналитического ультрацентрифугирования (AUC).

Проточные цитомеры

 Проточные цитометры Beckman Coulter для научных и клинических приложений сочетают в себе лучшие характеристики подобных инструментов и задают новые стандарты в отношении компактности, универсальности и мощности.

Дозирующие станции

 Несколько моделей в различных конфигурациях помогут вам оптимизировать рабочие процессы и сэкономить время сотрудников в ходе фундаментальных исследований, геномных приложений и разработки лекарств.

Клеточные анализаторы

 Наши счетчики Культера позволяют одновременно определять распределение по размерам, объем и площадь поверхности суспендированных частиц размером от 0,4 до 1 600 мкм.

Результаты исследований, стандарты, документы, видео и др.

 

Видео: Анализ клеток с помощью принципа Культера