Разработка и получение вирусных векторов: будущее генной терапии

Д-р Йоханнес ван дер Лу рассказывает о получении вирусных векторов

Dr. Johannes van der Loo

За последние почти 40 лет складывается впечатление, что генная терапия развивалась, делая шаг вперед, а затем два шага назад.

Благодаря таким ученым, как доктор Йоханнес (Хан) ван дер Лу, такое положение может измениться.

Будучи первопроходцем в разработке моделей получения вирусных векторов, д-р ван дер Лу предсказывает для генной терапии в ближайшие годы только поступательный импульс. И он не одинок.

В 2015 году размер рынка генной терапии онкологических заболеваний составлял 805,5 млн. долл. США, при этом среднегодовой темп роста по прогнозам должен был превышать 20 % до 2024 года. 1 Эксперты прогнозируют, что рынок генной терапии в 2025 году составит 11 млрд. долл. США. 2

Это впечатляющий рост для области исследований, где на сегодняшний день получено всего пять одобренных к применению средств, причем только одно из них поступило в коммерческую продажу за пределами Азии (и то только в странах ЕС). 2

Однако д-р ван дер Лу отмечает, что новые методы генной терапии уже находятся на поздних стадиях разработки, и еще на подходе по всему миру есть другие.

И это даст генной терапии мощный импульс продолжать важные исследования в области разработки безопасных вирусных векторов, которые в будущем доставят в нужную точку спасающие жизнь лекарства.

Категории и типы вирусных векторов

Д-р ван дер Лу объясняет, что в генной терапии векторы делятся на три основные категории:

1. Интегрирующие вирусные векторы (например, гаммаретровирус и лентивирус), которые интегрируются в геном клетки-мишени и таким образом реплицируются в дочерние клетки в результате митоза.

2. Неинтегрирующие вирусные векторы (например, аденовирус и аденоассоциированный вирус), которые остаются эписомными, тем самым потенциально снижая онкогенез.

3. Невирусные векторы, например, плазмидная ДНК. 

Другими распространенными типами вирусных векторов являются альфавирус, вирус герпеса и вакциния.

При выборе вирусного вектора, – говорит доктор ван дер Лу, – сначала необходимо решить, какой вектор вам нужен, интегрирующий или неинтегрирующий.

«Если, например, целью является гемопоэтическая стволовая клетка, которая будет делиться и производить многочисленное потомство, – поясняет он, – лучшим выбором является интегрирующий вирусный вектор, потому что интегрированный ген будет передаваться в дочерние клетки. Однако если ткань состоит из неделящихся клеток, мы можем использовать неинтегрирующий вектор».

Дополнительными соображениями будут избирательность вирусного вектора, тип клеток, на которые он нацелен, и потенциальные проблемы токсичности и генотоксичности.

С тех пор, как в 2002 году обнаружилось, что у некоторых пациентов, которым был проведен перенос генов с помощью гаммаретровирусных векторов, вследствие инсерционного мутагенеза развилась лейкемия 3, в генной терапии на основе клеток стал учитываться риск генотоксичности. Этот риск ассоциируется не только с интегрирующими ретровирусными векторами, но и с неинтегрирующими векторами, такими как AAV. 4 Хотя низкая иммуногенность вектора AAV до сих пор не вызывала острых побочных эффектов, в нескольких клинических исследованиях она вызывала иммунотоксичность, которая могла препятствовать достижению терапевтических результатов. 5,6

Наконец, важно учитывать стабильность вирусного вектора in vitro и in vivo, а также определить наилучший способ его безопасного получения и очистки. Здесь-то и выходят на сцену д-р ван дер Лу и его коллеги.

Сравнение методов получения вирусных векторов

«Существует три основных способа получения вирусных векторов: использование стабильной пакующей клеточной линии, использование переходной трансфекции и использование инфекции», – объясняет д-р ван дер Лу. «Под методом, использующим инфекцию, я имею в виду бакуловирусную систему, разработанную Робертом Котиным, когда он работал исследователем в Национальном институте здравоохранения. Для упрощения я остановлюсь в этой статье только на двух других методах».

Он начинает с изложения основ: Использование стабильной линии-производителя подразумевает стабильно интегрированные гены Gag/Pol и env, необходимые для создания вирусной частицы. Но здесь отсутствует сама векторная последовательность, которая обычно вводится в виде вируса или плазмиды. Поскольку использование плазмиды является неэффективным методом получения вирусного вектора, способного к интеграции, то их обычно получают с использованием вируса.

Затем клетки выращивают, выбирают клон, а затем из этого клона создается маточный банк клеток. После того, как маточный банк клеток будет создан и сертифицирован, как только клеткам позволят оттаять и поместят их в питательную среду, они начнут производить вирусный вектор.

Производство с помощью стабильной линии-производителя относительно несложно и легко масштабируется. Обычно партии мало варьируют между собой, хотя этот метод по своей сути не столь гибкий.

«После того, как вы выберете вирусный вектор и последовательность генов, у вас больше не остается выбора, – говорит д-р ван дер Лу, – потому что когда вы отберете свои клоны и создадите маточный банк клеток, вы не сможете больше вносить никакие изменения».

В отличие от использования стабильных линий-производителей, для переходной трансфекции требуется всего три дня, причем все векторы производятся из одного маточного банка клеток.

«Таким образом, получение партии векторов становится относительно быстрым и чрезвычайно гибким, так как вектор можно изменять вплоть до момента получения», – говорит он.

Однако производство здесь более сложное и трудно масштабируемое, чем при использовании стабильной линии-производителя, и если процесс не будет контролироваться надлежащим образом, возможен разброс от партии к партии. Одной из причин этого является то, что процесс переходной трансфекции неизменно связан с загрязнением плазмидами, которые необходимо удалить при производстве и очистке.

Очистка вирусных частиц ультрацентрифугированием

Одним из методов, которые д-р ван дер Лу и его коллеги используют для очистки вирусных частиц, является ультрацентрифугирование в градиенте плотности, которое эффективно разделяет полные и пустые вирионы. В качестве изоосмотического раствора для всех плотностей, необходимых для этого метода, можно использовать йодиксанол.

Учитывая критический характер дальнейшего использования продукта, соблюдение требований GMP при ультрацентрифугировании является ключевой необходимостью. Важно понимать, что пробирки и крышки поставляются нестерильными, а стерилизация – гамма излучение, обработка окисью этилена или термическая обработка – может нарушить целостность пробирки.

«Поэтому мы всегда изучаем информацию изготовителей этих материалов о химической совместимости и допустимой стерилизации», – говорит он. «И если процесс используется для последующих клинических испытаний, то метод должен пройти валидацию».

Далее он описывает основной процесс очистки, который использовал он сам и его коллеги:

«После добавления вируса, который имеет самую низкую плотность, мы вводим под него слой йодиксанола с различными концентрациями, – говорит он, – и следим за тем, чтобы мениск находился чуть ниже ниппеля пробирки.

«Затем пробирку запечатывают, и после центрифугирования вирус собирается в зоне 40 % концентрации йодиксанола, поверх зоны с 54 % концентрацией. После того, как мы вставим иглу в верхнюю часть пробирки, чтобы уравновесить давление, мы вводим другую иглу сбоку в пробирку для отбора вируса».

Поскольку этот процесс нестерильный, – отмечает он, – необходимо перед запуском продезинфицировать ротор, а перед отбором вируса протереть пробирку. И наконец, д-р ван дер Лу советует профильтровать конечный продукт, используя фильтр, по меньшей мере, 0,2 мкм.

Он также отмечает, что этот процесс требует тщательной подготовки персонала, потому что он высокоэффективен в той же степени, что и сложен. «Мы успешно использовали его для получения векторов AAV для клинического исследования фазы IIA, – говорит он, – что потребовало от нас применения в общей сложности 480 градаций йодиксанола».

Клинические проблемы при использовании вирусных векторов в генной терапии

Использование сложных молекулярных процессов, сформировавшихся на протяжении миллионов лет эволюции – нашей и вирусов – не проходит без проблем, как признает доктор ван дер Лу.

«Начнем с того, что огромная проблема заключается в том, чтобы выявить и обеспечить соответствующий уровень генной коррекции, необходимый для конкретного заболевания», – говорит он. «Это и необходимое количество копий, и количество интеграций для встраивания векторов, и количество клеток, которые должны быть преобразованы».

«Во-вторых, важно определить уровень экспрессии терапевтического гена; обычно он зависит от выбора промотора – сильного или слабого – который определяет, какого уровня экспрессии мы достигнем, высокого или низкого».

«В-третьих, это потенциальная возможность инсерционного мутагенеза. Мы знаем, что векторы, которые интегрируются в геном, могут влиять на гены в области интеграции, и устранение потенциальной возможности инсерционного мутагенеза представляет собой постоянную проблему».

«Четвертой проблемой является подавление экспрессии генов, которая является важным фактором для интеграции векторов, развития иммунного ответа на вектор (который определяет выбор способа введения), типа и чистоты вектора и биораспределения вещества после его введения в организм».

«Наконец, мы должны учитывать побочную экспрессию, хотя мы знаем, что использование специфичных для тканей промоторов может помочь решить эту проблему».

Другие извлеченные уроки

Какие уроки из тех, что доктор ван дер Лу извлек за многие годы работы в области генной терапии, он считает самыми важными?

«На ранних стадиях клинических испытаний важно провести риск-ориентированную оценку всего сырья по критическим критериям эффективности и, если возможно, заключить соглашение о качестве со всеми поставщиками материалов».

Он также понял важность использования формализованного технологического процесса при переносе процессов от разработки к GMP. «И никогда не следует недооценивать тот высокий уровень технической подготовки, который необходимо обеспечить, прежде чем вы будете готовы к началу производства», – отмечает он.

«Наконец, для крупномасштабного производства инвестируйте в масштабируемые технологии. В некоторых случаях это может быть ультрацентрифугирование, в других имеет смысл рассмотреть такие альтернативы, как хроматография».

Справочные материалы:
1. Можно получить по ссылке: URL: https://globenewswire.com/news-release/2016/09/13/871431/0/en/Cancer-Gene-Therapy-Market-size-to-exceed-4-3bn-by-2024-Global-Market-Insights-Inc.html.
2. Можно получить по ссылке: URL: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/gene-therapy-market-2015-2025/85.html.
3. Hacein-Bey-Abina S, Hauer J, Lim A, et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 2010;363(4):355–364.
4. Kaeppel C, Beattie SG, Fronza R, et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nat Med 2013;19(7):889–891.
5. Masat E, Pavani G, Mingozzi F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discov Med 2013;15(85):379–389.
6. Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood 2013;122(1): 23–36.

Свяжитесь с нами













Я согласен получать информацию о продукции, вебинарах, товарах и услугах компании Beckman Coulter, включая также информацию о продукции, товарах и услугах аффилированных компаний.



Заполняя данную форму вы соглашаетесь с нашей политикой конфиденциальности и политикой в отношении персональных данных.