Подсчет субпопуляций Т-, B- и NK-лимфоцитов методом проточной цитометрии в образцах цельной крови после длительного хранения

Violetta Headley1, Xiangyang Dong1, Raquel Cabana1, Veronica Trujillo1, Michael Thomas2, Robert Magari3, Elena Afonina1

1Отдел разработки клинических приложений, подразделение Life Sciences, Beckman Coulter, Inc.
2Исследовательский отдел, подразделение Life Sciences, Beckman Coulter, Inc.
3Клинический отдел, подразделение Diagnostics, Beckman Coulter, Inc.

Введение

Цитометрический анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической цельной крови широко используется при оценке иммунологического статуса пациентов с самыми разными заболеваниями. Зачастую его проводят в специализированных референсных лабораториях, которые удалены от места забора крови. Это может приводить к задержкам выполнения исследований после сбора образцов. Кроме того, подготовленная проба, нередко хранится некоторое время в лаборатории до проведения первичного или повторного анализа.

Результаты предыдущих исследований показали, что характеристики рассеяния и флуоресценции различных клеток цельной крови, хранящейся с добавлением ЭДТА, постепенно изменяются после отбора образца или подготовки пробы. Согласно общим наблюдениям, по мере хранения образца относительная доля T-лимфоцитов увеличивается, а количество обнаруживаемых B-лимфоцитов уменьшается (Nicholson, et. al 1993, Ekong, et al 1993, Jalla, et. al. 2004).

В данном исследовании авторы показывают, что новый метод AQUIOS-Tetra, разработанный для подсчета популяций T-, B- и NK-лимфоцитов, дает точные результаты для образцов с ЭДТА, хранившихся в течение до 24 часов после венепункции при комнатной температуре.

Метод анализа стабильности образца и подготовленных проб

Проточный цитометр AQUIOS CL с реагентами Tetra — это комплексная система подготовки и анализа проб методом проточной цитометрии. Она производит анализ в течение 3 минут после добавления в пробу, окрашенную антителами, лизирующего реагента.

Программное обеспечение управляет процессом, чтобы ограничить влияние избыточного лизирования. В настоящем исследовании образцы цельной крови анализировали через 24 часа после венепункции и после 3-минутного инкубирования подготовленных проб. Каждый образец тестировали в двух повторностях в каждой временной точке.

Таблица 1 Временные точки для каждого образца

Примечание: Для проведения регрессионного анализа необходимо было получить результаты тестирования, как минимумом, в трех временных точках.

Были исследованы 73 образца, взятых у здоровых и больных (ВИЧ-положительных) доноров. Дрейф (изменение) абсолютных и относительных значений для популяций CD3+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD3-/ CD19+ и CD3-/ CD56+16+ во всех повторностях оценивали путем сравнения данных в контрольной точке 0-0 и других временных точках (24-0, 24-3). Также рассчитывали 95 % доверительный интервал дрейфа.

Анализ дрейфа результатов, полученных на системе AQUIOS, в зависимости от срока хранения образцов

Данные моделировали в виде линейной функции образца с использованием смешанной модели, которая включала все собранные данные по каждой временной точке (0-0, 24-0 и 32-0). Пробы составляли случайный компонент модели, а «срок» использовался в качестве фиксированного эффекта линейной регрессии. Для анализа данных использовали стандартную функцию PROC MIXED программного обеспечения SAS 9.3. Дрейф (δсрок) в определенной временной точке рассчитывали как разность между откликом в этой временной точке и откликом в нулевой временной точке (t0).

Анализ дрейфа результатов, полученных на системе AQUIOS, в зависимости от срока выдержки подготовленных проб

Дрейф для подготовленных проб (δпроб) рассчитывали как разность между средним откликом проб, выдержанных в течение 24 часов и прошедших 3-минутную подготовку (24-3), и средним откликом проб, выдержанных в течение 24 часов и исследованных немедленно (24-0). δпроб = X24 ч + 3 мин – X24 ч, где X24 ч + 3 мин и X24 ч — соответствующие средние значения. Стандартную ошибку полученного дрейфа (σпробрассчитывали как стандартную ошибку разности между этими двумя временными точками.

Анализ общего дрейфа результатов в системе AQUIOS

Дрейф при заявленной стабильности (выдержка в течение 24 ч и подготовка в течение 3 мин) рассчитывали как сумму компонента возраста образцов и компонента подготовленных проб по следующей формуле: δобщ = δсрок + δпроб. Доверительные интервалы дрейфа рассчитывали на основе стандартной ошибки дрейфа и 95 % доверительного интервала.

Результаты

Таблица 2 Средние значения полученного дрейфа в каждой временной точке

 

Таблица 3 Оценка стабильности образца и подготовленных проб

Выводы

На основании результатов данного исследования можно сделать вывод о том, что проточный цитометр AQUIOS CL с реагентами Tetra обеспечивают точные результаты при анализе популяций T-, B- и NK-лимфоцитов в образцах крови здоровых и больных доноров, собранных в пробирки с ЭДТА K3 и хранившихся при комнатной температуре до 24 часов.

AQUIOS CL — лазерное устройство класса I.

Полезные ссылки

Скачайте брошюру "Стратегия гейтирования в приложении AQUIOS Tetra"

Стратегия гейтирования в приложении AQUIOS Tetra

СКАЧАТЬ↓

Хотите задать вопрос специалисту? Заполните форму ниже.

HIV Advanced Disease Management

Man pipetting in biosafety hood

HIV Advanced Disease Management Solutions

Monitoring CD4 lymphocyte counts is essential in providing critical information that impacts patient care. CD4 monitoring allows caregivers to know when the disease transforms and stage its progression so they can implement the most appropriate intervention.. 
Tube with NK cell test on a label

Fast Throughput Subset Analysis with AQUIOS CL

In the clinical management of immune deficiency diseases, accurately counting the absolute cell numbers of leukocyte subsets and measuring the percentage of individual subtypes in blood is critical.
Comparing AQUIOS PLG to FC500 FlowCARE PLG

Comparing the AQUIOS CL PLG Application to the FC500 MCL FlowCARE PLG Application

Based on this study, the data suggests a strong correlation between the AQUIOS CL PLG application and the FC500 MCL FlowCARE PLG application.
Man holding K3 EDTA tube with blood sample

AQUIOS CL Tetra and Aged Whole Blood samples​

Based on this study, the AQUIOS CL instrument with Tetra application provides accurate results for recovery of the T, B and NK lymphocyte subsets in clinical and normal specimens collected into the EDTA K3 tubes when stored at room temperature for up to 24 hours.
AQUIOS reagent tracking system

Error Prevention on AQUIOS CL overview

Laboratory standards and regulations set forth by governmental bodies such as the Centers for Disease Control (CDC) help to define the procedures that laboratories follow
Manual Sample Data Entry

Error prevention during Startup and Worklist creation

The AQUIOS CL system employs several features that work to prevent errors during startup, cleaning, and worklist generation, including Autocleaning, Test Requests to and from the LIS and Creating Worklists.
AQUIOS CL Sample Preparation Systems

Error Prevention During Sample Prep

The AQUIOS CL system employs several features that work to prevent errors during sample prep.
AQUIOS Immunotrol Low

Error Prevention During Quality Control

The AQUIOS CL system employs several features that work to prevent errors during quality control, including Automatically Pause when QC Fails, QC Checks, Daily QC (Controls), Real Time QC (Patient Sample).