вВыделение и характеризация экзосом для анализа и исследований и методов изв области «-омика».

Выделение экзосом может сопровождаться техническими трудностями, связанными с присутствием в процессе очистки таких контаминантнов, как микровезикулы, частицы липопротеинов, микробы, микросомы, белковые агрегаты, а также ДНК и другие продукты некроза.1 Это мешает точной характеризации экзосом и их использованию для исследований и последующих приложений.1 Характеризация экзосом важна не только для понимания их свойств и функции. Идентнификация уникальных экзосомальных маркерных белков может помочь установить способы, с помощью которых можно проводить оценку проб на наличие экзосом. Стандартизация методов выделения может позволить получать большие объемы более качественных образцов экзосом, а также повысить воспроизводимость результатов, получаемых с помощью экзосомальных препаратов. Хотя экзосомы привлекли к себе внимание не только возможностью использования для диагностики заболеваний и в терапевтических методах, определение чистоты образов является неотъемлемым требованием использования экзосомальных технологий в клинических условиях, потому что примеси в экзосомальных пробах могут приводить к нежелательным побочным эффектам. В ходе клинической диагностики наличие контаминантов в пробе может стать причиной ложноотрицательных или ложноположительных результатов, приводящих к ошибочной  постановке диагноза  пациенту.2

Методы выделения экзосом

Экзосомы секретируются большинством типов клеток и, следовательно, могут быть выделены из клеточной культуры, а также из биологических жидкостей, в том числе плазмы, мочи, слюны, сыворотки и спинномозговой жидкости.3 Для разных типов проб были разработаны протоколы выделения экзосом, основанные на таких методиках, как центрифугирование с разной скоростью, фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности и т.д.1 Наиболее широко практикуемым методом выделения и очистки экзосом из различных источников является дифференциальное ультрацентрифугирование,4 при котором серия осаждений способствует пошаговому устранению из изолята таких контаминантов, как мертвые клетки, клеточный дебрис, тромбоциты, белки, комплексы и агрегаты нуклеиновых кислот и др.1 Однако контаминанты неэкзосомальной природы, например, частицы липопротеинов, вирусы и бактерии, микросомы, ДНК и продукты некроза (такие как апоптотические тельца), а также белковые агрегаты, все же могут оставаться.

Другие методики выделения экзосом, часто используемые в комбинации с дифференциальным центрифугированием, включают: градиент плотности йодиксанола, преципитацию, ультрафильтрацию, иммуноаффинное выделение, эксклюзионную хроматографию и микрогидродинамические методики.5 Каждый метод имеет преимущества и недостатки, поэтому следует уделить внимание выбору метода, который наилучшим образом послужит для последующего применения. Кроме того, некоторые методы выделения и очистки могут давать самый высокий выход белка, однако делают эти везикулы непригодными для некоторых приложений.5 Например, эксклюзионная хроматография позволила получить высокоочищенные пробы с относительно низкими уровнем содержания контаминанов, стоимостью метода и временем обработки. Однако конечная проба может быть сильно разведенной. К тому же метод позволяет одномоментно обрабатывать только одну пробу, а сам процесс  выделения может быть трудоемким.5

Содержимое пробы неэкзосомальной природы представляет собой значительную проблему для анализа экзосомальных характеристик, а также применения таких образцов для анализа и других приложений.1 Контаминантами, устранение которых из препаратов везикул может вызывать трудности, являются частицы липопротеинов, микробы, микросомы, белковые агрегаты, а также ДНК и другие продукты некроза.1 В зависимости от предполагаемого последующего применения очищенных экзосом можно предпринять дополнительные шаги для устранения контаминантов из очищенной экзосомальной пробы. Например, было показано, что препараты экзосом, приготовленные с помощью градиента плотности йодиксанола, имеют высокую чистоту, о чем свидетельствует накопление экзосомального маркера CD63 и отсутствие загрязняющих белков, таких как внеклеточные комплексы Argonaute-2.6 Обычный метод определения количества контаминантного белка состоит в сравнении соотношения количеств нановезикул (полученных посредством таких технологий визуализации, как платформа NanoSight) к концентрации белка (полученной колориметрическими методами анализа белка, такими как исследование с бицинхониновой кислотой [bicinchoninic acid, BCA]).7 Присутствие контаминантных белков изменяет это соотношение и, таким образом, влияет на оценку чистоты экзосомальной пробы. По опубликованным данным степень чистоты проб с соотношениями больше 3 x 1010 частиц на мкг белка считается высокой, тогда как соотношения от 2 × 109 до 2 × 1010 частиц на мкг говорят о низкой чистоте проб.7 При разработке протокола выделения рекомендуется оценивать и оптимизировать пробы не только на предмет присутствия экзосом, но также и на предмет отсутствия загрязняющих факторов.

Характеризация экзосом

Для определения количества и степени чистоты экзосом после их очистки используют несколько стандартных методик.5 Анализ динамического светорассеяния совместно с аналитическим ультрацентрифугированием приводит к избирательному обогащению экзосомами определенных размеров на основании формы их следа при рассеянии света.

Масс-спектрометрия может применяться для выявления белкового содержимого в экзосомах и определения возможного содержания в пробе белковых агрегатов либо других контаминантов.5 Электронная микроскопия может быть использована для визуализации морфологии и размера везикул, а в комбинации с иммунной маркировкой — для определения особенностей экзосом, таких как содержание специфических поверхностных белков.1 С помощью стандартного вестерн-блоттинга можно выявить присутствие определенных белков в пробе, но невозможно определить количество экзосом. Другие методики, которые использовались для оценки качества и количества препаратов экзосом, включают: атомно-силовую микроскопию, оптическое отслеживание траектории одной частицы, проточную цитометрию и импульсное резистивное зондирование.1

Для подтверждения присутствия экзосом в препаратах был идентифицирован и использован ряд экзосомальных маркеров.8 Обычные белковые маркеры включают Alix, TSG101, CD9 и CD63. Также предполагают, что экзосомы обогащены такими белками, как DIP2B и члены семейства 4-трансмембранных белков.2 Однако не все экзосомы содержат эти белки. Интерактивная база данных ExoCarta (http://www.exocarta.org/) — это инструмент, помогающий исследователям в определении и характеризации экзосомального содержимого. База данных содержит белки, последовательности РНК и липиды, которые были идентифицированы в отдельных экзосомальных препаратах. Идентификация белковых маркеров в экзосомах, происходящих, например, из опухоли, может использоваться для разработки клинико-диагностического теста опухолей у пациентов.

Стандартизация выделения и характеризации экзосом являются основными этапами для получения надежных и воспроизводимых результатов исследований и использования в последующих приложениях, в том числе клинических и терапевтических. Бесчисленные источники сбора экзосом, а также множество методик выделения, создали множество трудностей для стандартизации протоколов и получения последовательных и воспроизводимых результатов.1 Узнайте, как автоматизация технологического процесса может облегчить выделение и характеризацию экзосом.

Ссылки:

1. Witwer, K. W., Buzás, E. I., Bemis, L. T., Bora, A., Lässer, C., Lötvall, J., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.20360.

2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H.-J., Takahashi, N. and Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J. Clin. Invest. (2016) 126, 1152–1162. doi: 10.1172/JCI81129.

3. El Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O. and Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12, 347–357. doi: 10.1038/nrd3978.

4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G. & Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Editor. Board Juan Bonifacino Al (2006) Chapter 3, Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

5. Abramowicz, A., Widlak, P. and Pietrowska, M. Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation. Mol. Biosyst. (2016) 12, 1407–1419. doi: 10.1039/c6mb00082g.

6. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.

7. Webber, J. and Clayton, A. How pure are your vesicles? J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.

8. Mathivanan, S. and Simpson, R. J. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics (2009) 9, 4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351.

Свяжитесь с нами













Я согласен получать информацию о продукции, вебинарах, товарах и услугах компании Beckman Coulter, включая также информацию о продукции, товарах и услугах аффилированных компаний.



Заполняя данную форму вы соглашаетесь с нашей политикой конфиденциальности и политикой в отношении персональных данных.