Выделение и характеризация экзосом для последующего применения

Exosome Research IllustrationВыделение экзосом может сопровождаться техническими трудностями, связанными с устойчивостью контаминантов, в том числе микровезикул, липопротеиновых частиц, микробов, микросом, белковых агрегатов, ДНК и других продуктов некроза. Это усложняет точную характеризацию экзосом, их количественный анализ и последующее применение.1

Характеризация экзосом важна не только для понимания их свойств и функций. Идентификация уникальных экзосомальных белковых маркеров, например, позволяет определять наличие этих микровезикул в образцах.

В последнее время повышенное внимание привлекает потенциальная возможность использования экзосом для диагностики и лечения заболеваний. И обязательным условием внедрения этих технологий в клинические условия становится определение чистоты экзосомальных образцов.

В противном случае контаминанты могут стать причиной ложно положительных и ложно отрицательных результатов анализов и постановки неправильного диагноза.2 Также примеси в образцах, предназначенных для лечения заболеваний, могут оказывать нежелательные побочные эффекты.

Стандартизация методов выделения может улучшить количество и качество экзосом и повысить воспроизводимость результатов, получаемых с их помощью.

Методы выделения экзосом

Экзосомы секретируются клетками большинства типов. Следовательно, их можно выделить как из клеточных культур, так и из биологических жидкостей, в том числе плазмы, мочи, слюны, сыворотки и спинномозговой жидкости.3

Протоколы выделения экзосом адаптированы для каждого типа клеток путем подбора оптимальных условий, например скорости центрифугирования, использования фильтрации и градиентов плотности и другими способами.1

Наиболее широко применяемым методом выделения и очистки экзосом из различных источников является дифференциальное ультрацентрифугирование.4 Оно выполняется в несколько этапов, в ходе которых постепенно сокращается количество таких контаминантов, как мертвые клетки, клеточный дебрис, тромбоциты, белки, комплексы и агрегаты нуклеиновых кислот и др.1 При этом неэкзосомальные примеси, например, липопротеиновые частицы, вирусы и бактерии, микросомы, ДНК, продукты некроза (такие, как апоптотические тельца) и белковые агрегаты, могут сохраняться.

Другими методами выделения экзосом являются: центрифугирование в градиенте плотности йодиксанола, преципитация, ультрафильтрация, иммуноаффинная очистка, гель-фильтрация и микродинамические методы.5 Зачастую они используются в комбинации с дифференциальным ультрацентрифугированием.

Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. Выбранный метод должен лучше всего учитывать особенности последующего применения.5 Например, гель-фильтрация дает возможность достаточно быстро и дешево получать высокоочищенные образцы экзосом с относительно небольшим содержанием примесей. Однако такие препараты могут быть сильно разбавлены, и в каждый момент времени можно будет работать только с одним образом, что делает процесс слишком трудоемким.5

Содержимое неэкзосомального происхождения в образце является существенной помехой для характеризации экзосом, а также их использования для анализа и других приложений.1 Удалить из препарата микровезикул некоторые контаминанты, например, липопротеиновые частицы, микробы, микросомы, белковые агрегаты, а также ДНК и продукты некроза, может быть не так-то просто.1

В зависимости от предполагаемого последующего применения можно предпринять дополнительные шаги для устранения контаминантов из очищенной экзосомальной пробы. Например, было продемонстрировано, что препараты экзосом, полученные методом центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола, характеризуются высокой чистотой, о чем свидетельствует повышенное содержание экзосомального маркера CD63 и отсутствие загрязняющих белков, таких как внеклеточные комплексы Argonaute-2.6.6

Общий метод оценки количества белков-контаминантов состоит в вычислении соотношения количества нановезикул (определенного с помощью технологий визуализации, например, на платформе NanoSight) и концентрации белков (определенной колориметрическими методами, например, с бицинхониновой кислотой).7 Присутствие загрязняющих белков влияет на это соотношение, что позволяет оценить чистоту образца экзосом.

По опубликованным данным препараты, в которых количество экзосом превышает 3 × 1010 на 1 мкг белка, считаются высокоочищенными. Если это соотношение составляет от 2 × 109 до 2 × 1010 везикул на 1 мкг белка, то препарат имеет низкую чистоту.7

При разработке протокола выделения рекомендуется анализировать образцы и оптимизировать метод не только с целью увеличения содержания экзосом, но и для уменьшения количества контаминантов.

Характеризация экзосом

Для определения количества, чистоты, а также характеризации экзосом после очистки используют несколько стандартных методик.5

Анализ методом динамического светорассеяния (DLS) в сочетании с аналитическим ультрацентрифугированием позволяет выборочно обогащать препарат экзосомами определенных размеров на основании их характеристик светорассеяния.

Масс-спектрометрия дает возможность идентифицировать экзосомальные белковые грузы и определять, содержит ли образец белковые агрегаты и другие контаминанты.5

Электронную микроскопию можно использовать для визуализации морфологии и размеров везикул, а в сочетании с иммунным мечением – для определения специфических свойств экзосом, например, состава поверхностных белков.1

Традиционный вестерн-блоттинг дает возможность установить присутствие в образце определенных белков, но не позволяет определить количество экзосом.

Другими методами для определения количества и качества экзосом в препарате являются: атомно-силовая микроскопия, оптическое слежение за отдельными частицами, проточная цитометрия, резистивное импульсное зондирование.1

Ряд идентифицированных экзсомальных маркеров позволяет подтверждать присутствие в препаратах экзосом.8

Набор общих белковых маркеров включает в себя Alix, TSG101, CD9, CD63. Считается, что экзосомы обогащены и другими белками, например DIP2B и членами семейства тетранспанинов. Однако не все экзосомы содержат эти белки.

Онлайн-база данных ExoCarta (http://www.exocarta.org/) – это инструмент, помогающий исследователям идентифицировать и характеризовать экзосомальные грузы. Она содержит информацию о белках, последовательностях РНК и липидах, которые были идентифицированы в специфических препаратах экзосом.

В перспективе, определение белковых маркеров экзосом, выделяемых опухолевыми клетками, позволит разработать тесты для клинической диагностики опухолей у пациентов.

Стандартизация выделения и характеризации экзосом – важный шаг для получения надежных и воспроизводимых результатов в ходе последующего анализа и различных приложений, в том числе клинических и терапевтических. Разнообразие источников, используемых для сбора экзосом, и методов выделения существенно усложняет задачу по стандартизации протоколов и получения согласующихся и воспроизводимых результатов.1

Узнайте, каким образом лабораторная автоматизация может облегчить выделение и характеризацию экзосом.

Список литературы

  1. Witwer, K. W., Buzás, E. I., Bemis, L. T., Bora, A., Lässer, C., Lötvall, J., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.20360.
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H.-J., Takahashi, N. and Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J. Clin. Invest. (2016) 126, 1152–1162. doi: 10.1172/JCI81129.
  3. El Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O. and Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12, 347–357. doi: 10.1038/nrd3978.
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G. & Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Editor. Board Juan Bonifacino Al (2006) Chapter 3, Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.
  5. Abramowicz, A., Widlak, P. and Pietrowska, M. Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation. Mol. Biosyst. (2016) 12, 1407–1419. doi: 10.1039/c6mb00082g.
  6. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.
  7. Webber, J. and Clayton, A. How pure are your vesicles? J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.
  8. Mathivanan, S. and Simpson, R. J. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics (2009) 9, 4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351.