Исследование заболеваний с использованием экзосомальных биомаркеров

Экзосомы — это небольшие (< 150 нм) циркулирующие мембраносвязанные везикулы, отпочковывающиеся от клеточных мембран посредством эндоцитоза и выделяемые путем экзоцитоза после слияния мембран мультивезикулярных телец1. Несмотря на свой незначительный размер, экзосомы содержат большой объем информации о здоровье  родительских клеток и органов. Поэтому они идеально подходят для диагностического применения в качестве биомаркеров заболеваний. Во время формирования экзосомы захватывают небольшую пробу ключевых компонентов клетки, таких как плазматическая мембрана (включая поверхностные белки), цитозоль, ДНК, РНК (включая мРНК и микроРНК) и белки. Выделение экзосом и анализ их составных частей может пролить свет на характерные изменения при патологических состояниях, что делает возможными более раннее обнаружение и менее инвазивную диагностику.

Минимально инвазивные методы характеризации и диагностики заболевания уже являются обыденными для некоторых заболеваний, при которых доступность пробы не ограничена, например разные виды рака крови и болезни кожи. При этом экзосомальные биомаркеры являются основным инструментом для разработки минимально инвазивных методов изучения естественной истории заболеваний, которые поражают части организма, из которых сложно или болезненно получать образцы, например головной и спинной мозг2-5, почки6-8, а также сердце и сосуды9, 10.

Источник экзосом

Экзосомы можно выделить практически из любой жидкости организма, но оптимальную диагностическую или прогностическую ценность имеют жидкости, находящиеся в прямом контакте с интересующим(и) органом(-ами). Для анализа патологического состояния в первую очередь имеет смысл выбирать кровь, поскольку она имеет контакт с каждой системой органов. На предмет содержания экзосом были успешно исследованы и другие биологические жидкости: амниотическая жидкость11, грудное молоко12, слюна11, слезы13 и моча14, 15. Эти так называемые жидкие биоптаты (термин впервые использован в научной литературе в 1974 г.)16 делают возможным неинвазивное наблюдение за функционированием системы органов через состав жидкостей, которые ее окружают, включая их экзосомальное содержимое.

Чистота препаратов экзосом является наиболее важным условием для надежных и воспроизводимых результатов, поэтому особое внимание следует уделить поддержанию чистоты жидкостей, содержащих экзосомы. При получении образца жидкости соблюдайте осторожность, чтобы избежать случайного загрязнения другими биологическими жидкостями. Если целевой жидкостью является кровь, то это не такая большая проблема.  Однако при заборе жидкости из других полостей (таких как субарахноидальное пространство позвоночника или синовиальная полость коленного сустава) следует предпринимать особые меры предосторожности во избежание загрязнения исследуемой пробы кровью. Даже при неинвазивном сборе жидкости (например, путем естественного мочеиспускания в чистую емкость) следует придерживаться наилучших методик во избежание загрязнения пробы.

Выделение экзосом

В настоящее время дли выделения экзосом из жидких биоптатов широко используют несколько методов: дифференциальное ультрацентрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности, микрофильтрацию, применение покрытых антителами магнитных гранул и микрогидродинамических устройств. При этом золотым стандартом считается метод дифференциального ультрацентрифугирования.17 И поскольку его применяют чаще всего, для воспроизводимости и надежности результатов особую важность имеют  использование правильного протокола и выбор подходящего ротора.18

Таблица 1. Сравнение методов выделения экзосом (адаптировано на основании 17)

метод выделения Преимущества недостатки
дифференциальное ультрацентрифугирование метод золотого стандарта, легко адаптируемый с учетом вязкости пробы длительное время центрифугирования, невозможность отделения вируса от экзосомы, попутное осаждение белка
центрифугирование в градиенте плотности меньшая степень нежелательного осаждения других фракций, специальные подходы дают возможность отделения от вируса неспецифическое осаждение объектов с одинаковыми размерами
микрофильтрация повышенная скорость взаимодействие матрикса/мембраны, попутное осаждение белков, неоптимальное восстановление
покрытые антителами магнитные гранулы высокоспецифическое выделение популяции экзосом не подходит для проб большого объема, экзосомы невозможно элюировать из гранул неповрежденными
микрогидродинамические устройства более низкая стоимость, требуется меньшее количество пробы вариабельность эффективности доступных протоколов

Какой бы метод вы ни выбрали, искусство выделения экзосом не преследует цели выделения как можно большого количества образца. Наилучшим руководством является здравый смысл и предыдущий опыт. Применение чрезмерно жестких граничных значений или требований к антигенности может нанести такой же урон, как и использование чрезмерно широких граничных значений или мягких требований к антигенности. Ключевым фактором и наивысшим приоритетом, о котором необходимо помнить, является чистота и целостность пробы. Бдительность на всех этапах процедуры выделения экзосом позволит сохранить чистоту пробы, предотвратить ее порчу и обеспечит надежность данных.  

Как и в случае любой мембраносвязанной структуры (от экзосом до животных клеток), грубое или ненадлежащее обращение может привести к лизису, а непреднамеренный лизис исследуемых экзосом до получения результата, является основной причиной потери пробы. Поэтому необходимо внимательно относиться к выполнению каждого этапа протокола, использовать рекомендуемые температуру и буфер, избегать воздействия на исследуемую пробу детергентов и матриксных металлопротеаз.

Неправильное обращение с исследуемыми пробами, особенно при выполнении промывки, может привести к полной потере пробы. Всегда маркируйте пробирки для отображения определенного этапа протокола — это может предотвратить отбраковывание супернатанта, который содержит ценные экзосомы, или отсеивание пробирки, содержащей осадок, который стоит сохранить.
В любом протоколе, который содержит несколько этапов промывки и удаления супернатантов, эта ошибка совершается наиболее часто.  Во время работы важно помнить об этом и  совершать выверенные, точные и методичные действия.

Создание профиля заболевания с помощью экзосом

Для диагностики или мониторинга прогрессирования заболевания с применением экзосомальных биомаркеров следует описать исходный здоровый или непатологический экзосомальный профиль. Для этого можно выполнить популяционное исследование с оценкой диапазона возможных вариаций здорового профиля, пролонгированное исследование экзосомального профиля одного пациента перед началом заболевания и после него (что требует или исключительного терпения, или счастливого совпадения) или  сравнение между экзосомами, образованными «нормальной» клеточной линией и «больной» клеточной линией. Последний вариант подойдет тем, у кого нет доступа к бесконечному источнику пациентов, которые не возражают против инъекций.

МикроРНК, содержащуюся в экзосомах исследуют для диагностики и прогнозирования заболеваний. Её присутствие или отсутствие используют в качестве биомаркера для прямого прогнозирования риска заболевания19, его наступления20, прогрессирования21 или ремиссии22. Выделение микроРНК из экзосомальных фракций было стандартизировано23 и в данный момент является широко используемым методом обогащения специфическими для заболевания микроРНК из всего организма или в пределах отдельной системы органов.

Исследование патологических состояний с помощью экзосомальных биомаркеров в линии клеток либо во всей популяции клеток человека является трудоемким процессом.  Это и является основной прогностической ценностью экзосом.  А ведь еще совсем недавно их считали всего лишь элементами выделительной системы клеток. Очевидно, что предстоит еще многое выяснить об этих крошечных циркулирующих месседжерах. С дополнительной информацией о выделении экзосом, жидких биоптатах и биомаркерах заболеваний можно ознакомиться по ссылке [ссылка на страницу beckman.com подлежит определению].

Упомянутая в настоящей статье компания Beckman Coulter, стилизированный логотип, а также продукция и служебные знаки Beckman Coulter являются торговыми марками или зарегистрированными торговыми марками Beckman Coulter, Inc. в Соединенных Штатах Америки и других странах.

Ссылки:

1. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.

2. Gui, Y., Liu, H., Lv, W., and Hu, X. Altered microRNA profiles in cerebrospinal fluid exosome in Parkinson disease and Alzheimer disease. Oncotarget. (2015) 6:37043-53.

3. Fiandaca, M.S., Kapogiannis, D., Mapstone, M., Boxer, A., Eitan, E., Schartz, J.B., et al. Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenic proteins in neutrally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimers Dement. (2015) 11:600-7.

4. Jagot, F. and Davoust, N. Is it worth Considering Circulating microRNAs in Multiple Sclerosis? Front. Immunol. (2016) 7:129. doi: 10.3389/fimmu.2016.00129.

5. Zhang, Z.G. and Chopp, M. Exosomes in stroke pathogenesis and therapy. J. Clin. Invest. (2016) 126:1190-7. doi: 10.1172/JCI81133.

6. Bruno, S., Porta, S., and Bussolati, B. Extracellular vesicles in renal tissue damage and regeneration. Eur. J. Pharmacol. (2016) pii: S0014-2999(16)30427-7. doi: 10.1016/j.ejphar.2016.06.058. [Epub ahead of print]

7. Santucci, L., Bruschi, M., Candiano, G., Lugani, F., Petretto, A., Bonanni, A., et al. Urine Proteome Biomarkers in Kidney Diseases. I. Limits, Perspectives, and First Focus on Normal Urine. Biomark. Insights. (2016) 11:41-8. doi: 10.4137/BMI.S26229.

8. Junker, K., Heinzelmann, J., Beckham, C., Ochiva, T., and Jenster, G. Extracellular Vesicles and Their Role in Urologic Malignancies. Eur. Urol. (2016) 70:323:31. doi: 10.1016/j.eururo.2016.02.046.

9. Cheow, E.S., Cheng, W.C., Lee, C.N., de Kleijn, D., Sorokin, V., and Sze, S.K. Plasma-derived extracellular vesicles contain predictive biomarkers and potential therapeutic targets for myocardial ischemic injury. Mol. Cell. Proteomics. (2016) pii: mcp.M115.055731. [Epub ahead of print]

10. Kishore, R., Garikipati, V.N., and Gumpert, A. Tiny Shuttles for Information Transfer: Exosomes in Cardiac Health and Disease. J. Cardiovasc. Transl. Res. (2016) 9:169-75. doi: 10.1007/s12265-016-9682-4.

11. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A.K., Janssen, J.W., and Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. (2011) 9:86.

12. Admyre, C., Johansson, S.M., Rahman Qazi, K., Filen, S-J.,Lahesmaa, R., Norman, M., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J. Immunol. (2007) 179:1969-78. doi: 10.4049/jimmunol.179.3.1969.

13. Grigor’eva, A.E., Tamkovich, S.N., Eremina, A.V., Tupikin, A.E., Kabilov, M.R., Chernykh, V.V., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochemistry. (2016) 10:165-72.

14. Wiggins, R., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., and Beals, T. Lipid microvesicles and their association with procoagulant activity in urine and glomeruli of rabbits with nephrotoxic nephritis. Lab. Invest. (1987) 56:264-72.

15. Harpole, M., Davis, J., and Espina, V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Rev. Proteomics. (2016) 13:609-26.

16. Sorrells, R.B. Synovioanalysis (“liquid biopsy”). J. Ark. Med. Soc. (1974) 71:59-62.

17. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

18. Livshits, M.A., Khomyakova, E., Evtushenko, E.G., Lazarev, V.N., Kulemin, N.A., Semina, S.E., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci. Rep. (2015) 5:17319. doi:10.1038/srep17319.

19. Ghanbari, M., Ikram, M.A., de Looper, H.W., Hofman, A., Erkeland, S.J., Franco, O.H., et al. Genome-wide identification of microRNA-related variants associated with risk of Alzheimer’s disease. Sci. Rep. (2016) 6:28387. doi: 10.1038/srep28387.

20. Zhang, T., Shang, Q., Lv, C., Wang, C., and Su, B. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2015) 463:60-3. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.05.017.

21. Farr, R.J., Joglekar, M.K., and Hardikar, A.A. Circulating microRNAs in Diabetes Progression: Discovery, Validation, and Research Translation. EXS. (2015) 106:215-44. doi: 10.1007/978-3-0348-0955-9_10.

22. Freres, P., Wenric, S., Boukerroucha, M., Fasquette, C., Thiry, J., Bovy, N., et al. Circulating microRNA-based screening tool for breast cancer. Oncotarget. (2016) 7:5416-28. doi: 10.18632/oncotarget.6786.

23. Lasser, C. Identification and Analysis of Circulating Exosomal microRNA in Human Body Fluids. Methods in Molecular Biology. (2013) 1024:109-28. doi: 10.1007/978-1-62703-453-1_9.

Свяжитесь с нами













Я согласен получать информацию о продукции, вебинарах, товарах и услугах компании Beckman Coulter, включая также информацию о продукции, товарах и услугах аффилированных компаний.



Заполняя данную форму вы соглашаетесь с нашей политикой конфиденциальности и политикой в отношении персональных данных.