Экзосомы выносят поднимают моделирование заболеваний на новый уровень: из клетки на планшет

Исторически, самые популярные методы изучения патологического процесса включали моделирование на животных, гистологический анализ и биохимические исследования изменений экспрессии белков. Однако даже незначительное достижение в клеточной биологии способно оказать большое влияние на наш взгляд на болезни и их исследования. Экзосомы — это небольшие (120 нм) мембраносвязанные везикулы, которые клетки выделяют в окружающую и разделяющую их интерстициальную жидкость. Благодаря способу своего формирования путем отщепления от эндосом и слития с плазматической мембраной, экзосомы содержат пробы ДНК, РНК и белков (в том числе маркеров клеточной поверхности), которые находятся в родительской клетке.1 Чтобы сделать выводы о здоровье клеток органов или организмов, можно выполнить анализ макромолекул, находящихся в экзосомах, посредством их выделения, как правило, из жидкого биоптата.2 Это означает, что вместо забора почки у мыши, выполнения серийных срезов или проведения вестерн-блоттинга, а также окрашивания фенотипическим маркером заболевания, можно культивировать специфически для заболевания клеточные линии, выделить экзосомы из кондиционированной культурой клеток среды и создать профиль находящихся в них белков, ДНК и РНК.3 Такие факторы, как более высокая производительность, более низкая стоимость и более специфические для человка признаки болезни, являются причинами для рассмотрения возможности исследования мира экзосом.

Экзосомы при заболевании

Экозомы выделяют все или почти все здоровые клетки человека, а также нездоровые и находящиеся в состоянии стресса клетки. Следовательно содержимое экзосом зависит от состояния клеток. Действительно, анализ жидких биоптатов подтвердил, что циркулирующие экзосомы, полученные от пациентов с некоторыми заболеваниями, могут содержать аберрантыне белки4–6 и способствующие заболеванию нуклеиновые кислоты.7, 8 Была даже продемонстрирована передача этих состояний от организма к организму вследствие трансфузии экзосом.6

Во время перехода из здорового состояния в патологическое макромолекулы, находящиеся внутри экзосом, меняются в связи с измененнием гомеостаза при патологической нагрузке9, 10 Одновременно с этим увеличивается число выделяемых экзосом.11 Это явление обусловлено увеличением содержания внутриклеточного натрия вследствие возможной попытки подачи сигнала соседним клеткам о стрессе. Таким образом, выделение и создание профиля экзосом из клеток или тканей при известной патологии может пролить свет не только на биологическую функцию этих клеточных мессенджеров, но и на возможные терапевтические мишени, которые ранее были не известны.12

Диагностика заболевания in vitro

Хотя некоторые исследования экзосом при заболеваниях проводятся непосредственно на образцах биологических жидкостей (моча, слюна, кровь и т.д.), полученных от пациентов, существует другой метод анализа экзосомального профиля при различных заболеваниях. Показано, что клетки в культуре выделяю экзосомы в культуральныю среду . При этом существуют доказательства сравнимости экзосом из клеточных линий с экзосомами, полученными от пациентов с аналогичными диагнозами.13-17 Клеточные линии, собранные у пациентов с определенным заболеванием, поддерживают свой экзосомальный профиль в течение некоторого времени, постоянно выделяя экзосомы с одинаковым составом. Были охарактеризованы экзосомальные профиле при нескольких заболеваниях,18–23 что позволило экстраполировать результаты анализа экзосом, выделенных линией клеток, на экзосомы, полученные из жидкостного биоптата, и использовать неинвазивное или минимально инвазивное взятие жидких проб в качестве диагностических тестов для выявления экзосомальных биомаркеров заболевания.

Клеточные линии получают из проб тканей, обычно после хирургической биопсии тканей или резекции пораженной ткани. Некоторые специфические для заболевания клеточные линии способны выжить в культуре на протяжении длительного времени, вследствие спонтанной иммортализации, демонстрируемой опухолевыми клетками. Также клетки можно иммортализировать в лаборатории посредством индукции экспрессии онкогена, например, E1A. Таким образом создают нормальные или здоровые клеточные линии. В свою очередь первичные клеточные линии не являются бессмертными и способны поделиться только несколько раз перед старением и смертью. Выделение экзосом в первичных клетках невозможно удовлетворительно контролировать и воспроизводить, поэтому такие клетки не являются идеальным источником экзосом для исследования в культуре. Надлежащая практика требует сравнения достаточно похожих клеточных линий, чтобы только патологическое состояние влияло на экзосомальный профиль. Для правильной интерпритации данных сравнивайте экзосомы, выделяемые клеточной линией меланомы, с экзосомами, выделяемыми клеточной линией меланоцитов, а не клеточной линией рака толстой кишки.

Инженерные клеточные линии можно использовать для создания экзосом посредством модификации существующей клеточной линии и изменения или детализации ее экзосомальных грузов с применением различных методов молекулярной биологии и редактирования генома. Примеры применения модифицированных клеточных линий для продукции требуемых экзосом включают конъюгацию флуоресцентных или биолюминесцентных белков для отслеживания передвижения экзосом и изменения последовательностей содержащихся в экзосомах белков, ДНК или РНК для последующего исследования экзосомальной функции.24

Фенотипический анализ: «волшебные» свойства маркеров

Создание и выделение экзосом — это только первый шаг в характеризации заболевания in vitro. Следующий шаг заключается в создании профиля выделенных экзосом с набором фенотипических маркеров для подтверждения происхождения из определенных клеток и для сравнения изменений в профиле клеточной линии при патологическом состоянии с профилем клеточной линии в нормальном состоянии. Фенотипические маркеры, используемые для характеризации профилей экзосом, — это антитела, которые распознают белки, находящиеся в липидном бислое экзосом и везикулярном отсеке.

Поскольку единогласия относительно панели маркеров, которые могут подтвердить отличительные черты экзосомы, пока что не достигнуто, для идентификации экзосом используют несколько маркеров . Маркеры CD9, C81, MHC класса 2 – одни из общепринятых маркеров экзосом. Также экзосомы можно идентифицировать методом исключения микровезикул с позитивным GM130 и кальнексином, которые получены из частей родительских клеток, не участвующих в биогенезе экзосом. Наконец, экзосомы можно анализировать с помощью маркеров, специфичных для конкретных клеточных линий, чтобы определить тип родительских клеток и охарактеризовать их.

Сканирующая проточная цитометрия — это обычный метод для анализа идентифицированных по фенотипу экзосом, с помощью которого можно определить их размер и форму экзосомы. Кроме того, экзосомы можно анализировать с помощью иммунофлуоресценции, электронной микроскопии, вестерн-блоттинга или ИФА. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) также может применяться для характеризации нуклеиновых кислот, входящих в состав компонента экзосом.

Характеризация заболевания с помощью полученных из клеточной линии экзосом имеет несколько преимуществ перед традиционными методами анализа патологического состояния, включая более высокую производительность, более низкую стоимость и прямую применимость к исследованию заболеваний человека. С дополнительной информацией об использовании экзосом для исследований заболеваний, в том числе в качестве наноматериалов для доставки лекарственных препаратов, можно ознакомиться по НА СВОДНОЙ СТРАНИЦЕ СО СТАТЬЯМИ ОБ ЭКЗОСОМАХ.

Ссылки:

1. Keerthikumar, S., Gangoda, L., Liem, M., Fonseka, P., Atukorala, I., Ozcitti, C., et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget. (2015) doi: 10.18632/oncotarget.3801.

2. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

3. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

4. Emmanouilidou, E. and Vekrellis, K. Exocytosis and Spreading of Normal and Aberrant α-Synuclein. Brain Pathol. (2016) 26:398-403. doi: 10.1111/bpa.12373.

5. Fraser, K.B., Rawlins, A.B., Clark, R.G., Alcalay, R.N., Standaert, D.G., Liu, N., et al. Ser(P)-1292 LRRK2 in urinary exosomes is elevated in idiopathic Parkinson’s disease. Mov. Disord. (2016) doi: 10.1002/mds.26686. [Epub ahead of print]

6. Jeon, I., Cicchetti, F., Cisbani, G., Lee, S., Li, E., Bae, J., et al. Human-to-mouse prion-like propagation of mutant huntingtin protein. Acta Neuropathol. (2016) doi: 10.1007/s00401-016-1582-9.

7. Zhang, J., Li, S., Li, L., Li, M.,Guo, C., Yao, J., et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function. Genomics Proteomics Bioinformatics. (2015) 13:17-24. doi: 10.1016/j.gpb.2015.02.001.

8. Ye, S.B., Li, Z.L., Luo, D.H., Huang, B.J., Chen, Y.S., Zhang, X.S., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human naspharyngeal carcinoma. Oncotarget. (2014) 5:5439-52. doi: 10.18632/oncotarget.2118.

9. Lin, J., Li, J., Huang, B., Liu, J., Chen, X., Chen, X-M., et al. Exosomes: Novel Biomarkers for Clinical Diagnosis. ScientificWorldJournal. (2015) 6557086:1-8. doi: 10.1155/2015/657086.

10. An, T., Qin, S., Xu, Y., Tang, Y., Huang, Y., Situ, B., et al. Exosomes Serve as Tumour Markers for Personalized Diagnostics Owing to Their Important Role in Cancer Metastasis. J. Extracell. Vesicles. (2015) 4:27522. doi: 10.3402/jev.v4.27522.

11. Zhang, X., Yuan, X., Shi, H., Wu, L., Qian, H., and Xu, W. Exosomes in cancer: small particle, big player. J. Hematol. Oncol. (2015) 8:83. doi: 10.1186/s13045-015-0181-x.

12. Valenzuela, M.M., Ferguson Bennit, H.R., Gonda, A., Diaz Osterman, C.J., Hibma, A. Khan, S., et al. Exosomes Secreted from Human Cancer Cell Lines Contain Inhibitors of Apoptosis (IAP). Cancer Microenviron. (2015) 8:65-73. doi: 10.1007/s12307-015-0167-9.

13. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., and Mongini, C. Emerging Roles of Exosomes in Normal and Pathological Conditions: New Insights for Diagnosis and Therapeutic Appliations. Front. Immuno. (2015) 6:203. doi: 10.3389/fimmu.2015.00203.

14. Ipas, H., Guttin, A., and Issartel, J.P. Exosomal MicroRNAs in Tumoral U87 MG Versus Normal Astrocyte Cells. MicroRNA. (2015) 4:131-45.

15. Skog, J., Wurdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D.H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., et al. Glioblastoma microvesicle transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat. Cell Bio. (2008) 10:1470-6. doi: 10.1038/ncb1800.

16. Akers, J.C., Ramakrishnan, V., Kim, R., Phillips, S., Kaimal, V., Mao, Y., et al. miRNA contents of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in glioblastoma patients. J. Neurooncol. (2015) 123:205-26. doi: 10.1007/s11060-015-1784-3.

17. Jenjaroenpun, P., Kremenska, Y., Nair, V.M., Kremenskoy, M., Joseph, B., and Kurochkin, I.V. Characterization of RNA in exosomes secreted by human breast cancer cell lines using next-generation sequencing. PeerJ. (2013) 1:e201. doi: 10.7717/peerj.201.

18. Bellingham, S.A., Coleman, B.M., and Hill, A.F. Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells. Nucl. Acids Res. (2012) 40:10937-49. doi: 10.1093/nar/gks832.

19. Belov, L., Matic, K.J., Hallal, S., Best, O.G., Mulligan, S.P., and Christopherson, R.I. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic sigantures from blood samples. J. Extracell. Vesicles. (2016) 5:25355. doi: 10.3402/jev.v5.25355.

20. Xiao, D., Ohlendorf, J., Chen, Y., Taylor, D.D., Rai, S.N., Waigel, S., et al. Identifying mRNA, MicroRNA and Protein Profiles of Melanoma Exosomes. PLOS one. (2012) 7: e46874. doi:10.1371/journal.pone.0046874.

21. Zhong, S., Chen, X., Wang, D., Zhang, X., Shen, H., Yang, S., et al. MicroRNA expression profiles of drug-resistance breast cancer cells and their exosomes. Oncotarget. (2016) doi: 10.18632/oncotarget.7481. [Epub ahead of print]

22. Taylor, D.D., and Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos. Trans. R. So.c Lond. B Biol. Sci. (2014) 369:pii: 20130503. doi: 10.1098/rstb.2013.0503.

23. Ogata-Kawata, H., Izumiya, M., Kuioka, D., Honma, Y., Yamada, Y., Furuta, K. et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. PLOS one. (2014) 9: e92921. doi: 10.1371/journal.pone.0092921.

24. Hood, J. Post isolation modification of exosomes for nanomedicine applications. Nanomedicine. (2016) 11:1745-56. doi: 10.2217/nnm-2016-0102.



Свяжитесь с нами

















Я согласен получать информацию о продукции, вебинарах, товарах и услугах компании Beckman Coulter, включая также информацию о продукции, товарах и услугах аффилированных компаний.



Добровольно предоставляя нам свои персональные данные с целью рассылки информации рекламного характера, вы соглашаетесь с тем, что в силу специфики Интернета, ваши данные могут быть переданы за пределы границ Российской Федерации. Настоящим вы признаете и соглашаетесь, что такие персональные данные могут быть переданы из места вашего действительного нахождения в офисы и на серверы Beckman Coulter Inc., ее аффилированных лиц, агентов и поставщиков услуг, которые могут находиться в Европейском Союзе, Соединенных Штатах Америки и других странах. В случае передачи данных в страну, чьи законы, применимые к осуществляемым на Сайте операциям, не обеспечивают эквивалентную защиту данных, Beckman Coulter Inc. предпримет все меры, чтобы обеспечить надлежащий уровень защиты таких персональных данных в соответствии с настоящим согласием. Ознакомьтесь с нашей политикой конфиденциальности и политикой в отношении персональных данных.