Упрощение выделения экзосом

Автоматизация процесса выделения экзосом

Широко применяемым методом для выделения высокоочищенных фракций экзосом, считающимся для этих целей золотым стандартом, является дифференциальное ультрацентрифугирование1.

Автоматизация многоэтапного процесса выделения и характеризации экзосом может увеличить его скорость и улучшить точность, минимизируя при этом затраченное время и вариабельность между результатами. Несмотря на кажущуюся простоту принципа (многократное центрифугирование при разныхскоростях), стандартизация нескольких этапов технологического процесса ручными методами может быть затруднительна. Автоматизация дозирования жидкостей повышает качество выделяемых экзосом и обеспечивает воспроизводимость, отслеживаемость и точность получаемых с их помощью данных. Ниже рассказывается о том, как именно автоматизация позволяет выполнять более глубокий анализ, повышать гибкость метода на разных этапах, более точно определять незначительные изменения в грузах экзосом в разные моменты времени и при разных условиях.

Выращивание клеток до логарифмической фазы роста

Примечание. Если исследуемый вами исходный материал является биологической жидкостью из жидкого биоптата, вы можете пропустить эту подсказку.

Для большинства лабораторий выращивание клеток до логарифмической фазы является привычным делом. Для этого нужно лишь немного дополнительного времени и гемоцитометр. Причем дополнительного внимания требует не само выращивание клеток до логарифмической фазы, а их высевание перед выращиванием. Несмотря на усилия ученых, количество клеток, определенной с помощью гемоцитометра, часто может быть ошибочным по нескольким причинам, включая агрегацию, неоднородность смеси или неточный подсчет. Для предотвращения совершения ошибок, связанных с плотностью клеток, в ходе начальных этапоы выделения исследуемых вами экзосом , применяйте надежные счетчики клеток и автоматизируйте дозирование жидких среж для культивирования клеток. Это поможет обеспечить точность и стандартизацию, которых иногда не хватает в рутинной практической лабораторной работе.

Клетки, посеянные в недостаточном или чрезмерном количестве, требуют бдительного мониторинга с помощью спектрофотометра, чтобы не пропустить логарифмической фазы роста. А планшеты, с неточно подсчитанными культивируемыми клетками, могут быть не готовы к сбору экзосом в одно и то же время. Культивирование клеток с предсказуемой плотностью позволяет достичь логарифмической фазы в предсказуемое время, обеспечивая выполнение исследования по расписанию. При работе со сросшимися клетками млекопитающих обычно выращивается несколько сопутствующих культур, что позволяет оценить фазу роста с помощью спектрофотометра без разрушения экспериментальных клеток. Кроме очевидных преимуществ стандартизации вашего метода культивирования клеток, изучение типичных характеристик роста исследуемых клеток может помочь выявить проблемы с клетками или условиями работы с культурами. Если обычно исследуемые вами клетки достигают конфлюэнтности через 18 часов, а в текущем эксперименте клетки отстают или опережают график, возможно пришло время охарактеризировать новую аликвоту клеток. Также это может сигнализировать об изменении компонентов среды или условий инкубации.

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующий вопрос появится на странице в виде стилизированной выноски

Почему логарифмическая фаза роста имеет значение для сбора экзосом? Поскольку экзосомы являются желаемым конченым результатом, условия, в которых выращиваются клетки (и то, в каких условиях выделяются экзосомы), могут оказывать непосредственное влияние на количество экзосом и ценность их содержимого. Например, клетки, выращенные в условиях стресса (подобные встречавшимся в перенаселенных культурах стационарной фазы) , демонстрировали изменение содержимого экзосом в ответ на более жесткие условия окружающей среды.2

Если Вашей исследовательской целью является описание содержимого экзосом в нормальных условиях, важно собрать экзосомы в правильное время.

Выбор центрифуги для правильного ультрацентрифугирования

Работа на ультрацентрифуге совместного пользования может вызывать опасения. Это дорогой предмет оборудования, и все слышали страшные истории о людях, использующих непдоходящие пробирки, осуществляющих неправильный перевод скорости вращения в центробежное ускорение и повреждающих центрифугу, не говоря о потере ими с трудом полученных проб. Ультрацентрифугирование требует высокого уровня точности не только при подготовке проб, но также и при выборе правильного ротора для выполнения задачи. Выбор ротора с низким фактором k, который зависит от угловой скорости центрифуги и радиуса ротора, обеспечивает наиболее эффективное дифференциальное центрифугирование исследуемых проб.1 Например, бакетныйротор имеет большее различие между минимальным и максимальным радиусами ротора, чем угловой ротор. Это означает, что в угловом роторе одинаковые пробы должны очищаться быстрее с более точным разделением биочастиц в пределах градиента плотности, в соответствии с их изопикнической точкой, по сравнению с бакетным ротором. Следует помнить, что факторы k относятся к определенному ротору при использовании в конкретной центрифуге и их следует рассчитывать заново для каждой комбинации ротор/центрифуга. Следующей переменной, о которой следует помнить, является скорость, которая зависит от используемого ротора и выбранных параметров. Ключевым фактором для успеха выделения экзосом с помощью дифференциального ультрацентрифугирования является точный контроль скорости на протяжении точного периода времени. Инструмент для выбора ротора Beckman поможет вам правильно выбрать ротор, который обеспечит надлежащее осаждение исследуемых проб.

Приготовление градиента плотности

Градиенты плотности имеют важное значение для чистоты выделенных экзосом, поскольку для надежного отделения экзосом от частиц похожего размера (вирусов и небольших апоптотических телец) используется различие их плотности. Обычно градиенты плотности приготавливают из растворов сахарозы с увеличивающейся концентрацией, однако в более новых протоколах для улучшенного разделения и изоосмотической консервации размеров экзосом используют градиент йодиксанола. Часто предлагаются другие методы выделения экзосом, но по сравнению с ультрацентрифугированием в градиенте плотности ни один из них не дает лучшихрезультатов по чистоте экзосом и разнообразию их содержимого.3 Поскольку для чистоты собранных в ультрацентрифуге экзосомградиент плотности имеет главное значение, важно обеспечить точное приготовление составляющих растворов, а также его аккуратное наслоение. Автоматизация дозирования жидких сред является естественным решением этих задач. Устройство для автоматизированного дозирования жидких сред осторожно наносит слоями растворы йодиксанола/сахарозы для получения ступенчатого градиента плотности.

Определение размера и концентрации экзосом

После выделения экзосом можно непосредственно проанализировать присутствующие в них грузы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты и т.д.) или выполнить дополнительную характеризацию для получения информации о родительских клетках. Одним из этапов характеризации, который можно автоматизировать, является анализ размеров экзосом, основанный на траектории наночастиц. Устройство для анализа траекторий наночастиц (АТН) легко встраивается в процесс выделения и характеризации экзосом и дает возможность выполнить их точный и воспроизводимый анализна предмет распределения по размерам и концентрации в дилюенте.

Облегчение последующего анализа

В большинстве случаев главной целью выделения экзосом является не просто сбор, а исследование их грузов как средства для понимания этой недавно принятой во внимание формы межклеточной связи. Ученые успешно выделили из экзосом ДНК,4 РНК5, 6 и белок7, 8 и использовали их для анализа ключевых компонентов и влияния небольших мессенджеров. Некоторые методы такого анализа например, секвенирование РНК, требуют тщательной и воспроизводимой постановки несколькихпоследовательных реакций. Этого можно достичь с помощью автоматизации операций с жидкими средами. Другие методоы ,например ИФА, требуют приготовления планшетов, инкубации и условий для считывания планшетов., Все эти этапы можно выстроить в непрерывный технологический процесс с помощью быстрой, гибкой автоматизации.

Дифференциальное ультрацентрифугирование является эффективным и надежным методом выделения экзосом высокой чистоты. Многошаговый технологический процесс требует исключительной точности и воспроизводимости. Этого можно достичь с помощью автоматизации. Чтобы узнать больше об автоматизации выделения и характеризации экзосом, начните с прочтения этого указания по применению

Ссылки:

1. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

2. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., and Mittelbrun, M. Sorting it out: Regulation of Exosome Loading. Semin. Cancer Biol. (2014) 28:3-13. doi: 10.1016/j.semcancer.2014.04.009.

3. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles. (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.

4. Lazaro-Ibanez, E., Sanz-Garcia, A. Visakorpi, T., Escobedo-Lucea, C., Siljander, P., Ayuso-Sacido, A., et al. Different gDNA content in the subpopulations of prostate cancer extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles, and exosomes. Prostate. (2014) 74:1379-90. doi: 10.1002/pros.22853.

5. Stevanato, L., Thanabalasundraram, L., Vysokov, N., and Sinden, J.D. Investigation of Content, Stoichiometry and Tarnsfer of miRNA from Human Neural Stem Cells Line Derived Exosomes. PLoS One. (2016) 11:e0146353. doi: 10.1371/journal.pone.0146353.

6. San Lucas, F.A., Allenson, K., Bernard, V., Castillo, J., Kim, D.U., Ellis, K., et al. Minimally invasive genomic and transcriptomic profiling of visceral cancers by next-generation sequencing of circulating exosomes. Ann. Oncol. (2016) 27:635-41. doi: 10.1093/annonc/mdv604.

7. Winston, C.N., Goetzl, E.J., Akers, J.C., Carter, B.S., Rockenstein, E.M., Galasko, D., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. (Amst). (2016) 3:63-72. doi: 10.1016/j.dadm.2016.04.001.

8. Lasser, C., O-Neil, S.E., Shelke, G.V., Sihlbom, C., Hansson, S.F., Gho, Y.S., et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation. J. Transl. Med. (2016) 14:181. doi: 10.1186/s12967-016-0927-4.



Свяжитесь с нами

















Я согласен получать информацию о продукции, вебинарах, товарах и услугах компании Beckman Coulter, включая также информацию о продукции, товарах и услугах аффилированных компаний.



Добровольно предоставляя нам свои персональные данные с целью рассылки информации рекламного характера, вы соглашаетесь с тем, что в силу специфики Интернета, ваши данные могут быть переданы за пределы границ Российской Федерации. Настоящим вы признаете и соглашаетесь, что такие персональные данные могут быть переданы из места вашего действительного нахождения в офисы и на серверы Beckman Coulter Inc., ее аффилированных лиц, агентов и поставщиков услуг, которые могут находиться в Европейском Союзе, Соединенных Штатах Америки и других странах. В случае передачи данных в страну, чьи законы, применимые к осуществляемым на Сайте операциям, не обеспечивают эквивалентную защиту данных, Beckman Coulter Inc. предпримет все меры, чтобы обеспечить надлежащий уровень защиты таких персональных данных в соответствии с настоящим согласием. Ознакомьтесь с нашей политикой конфиденциальности и политикой в отношении персональных данных.