Автоматизация выделения экзосом

Molecule ModelМетод дифференциального ультрацентрифугирования считается «золотым стандартом» для выделения экзосом. Это связано с его массовым использованием и высокой чистотой получаемых экзосомальных фракций.

Несмотря на кажущуюся простоту метода (многократное центрифугирование при разных скоростях), стандартизация нескольких этапов протокола при его ручном выполнении может быть затруднительна.

Автоматизация многоэтапных процессов выделения и характеризации экзосом может не только увеличить их скорость, минимизировав при этом затрачиваемое время, но и повысить качество выделяемых экзосом, а также обеспечить воспроизводимость, прослеживаемость и точность получаемых данных.

Из этой статьи вы узнаете о том, как именно автоматизация позволяет выполнять более глубокий анализ, повышать гибкость метода на разных этапах и более точно определять небольшие изменения экзосомальных грузов в разные моменты времени и при разных условиях.

Выращивание клеток до логарифмической фазы

Примечание. Этот параграф можно пропустить, если в качестве исходного материала вы используете биологическую жидкость из жидкого биоптата.

Для большинства лабораторий выращивание клеток до логарифмической фазы является привычным делом. Это требует лишь немного дополнительного времени и наличие гемоцитометра, которые используются для посева клеток перед культивированием.

Несмотря на все усилия ученых, результаты измерений количества клеток, выполняемых с помощью гемоцитометров, часто бывают ошибочны по разным причинам, например, из-за агрегации, неоднородности смеси или неточностей подсчета. Чтобы ошибки измерений плотности клеток не мешали дальнейшему выделению экзосом, рекомендуем использовать надежные счетчики клеток и автоматизировать дозирование жидких сред для культивирования. Так вы сможете не только обеспечить точность результатов, но и стандартизировать процессы, чего иногда очень не хватает в рутинной лабораторной работе.

Клетки, посеянные недостаточно или слишком плотно, требуют бдительного мониторинга с помощью спектрофотометра, чтобы не пропустить логарифмической фазы роста. Планшеты, засеянные после неточного измерения плотности клеток, могут быть не готовы к сбору экзосом в одно и то же время. Если же посеять клетки, зная их точную плотность, можно заранее предсказать наступление логарифмической фазы и строго следовать плану исследований.

Как правило, при работе с адгезионными клетками млекопитающих ими одновременно засевают несколько культуральных сосудов. Это позволяет в дальнейшем определять фазы роста с помощью спектрофотометра и сохранять достаточно материала для экспериментов.

Следует добавить, что знание типичных характеристик роста может помочь выявить проблемы с клетками или условиями культивирования. Если обычно исследуемые вами клетки достигают конфлюэнтности через 18 часов, а в текущем эксперименте они отстают или опережают график, возможно, пришло время проанализировать аликвоту клеток. Также это может сигнализировать об изменении компонентов среды или условий инкубации.

Почему логарифмическая фаза роста имеет значение для сбора экзосом?

Условия, в которых выращивают клетки и выделяют экзосомальную фракцию, могут оказывать непосредственное влияние на количество экзосом и их содержимое. Например, для клеток, выращенных в стрессовых условиях (слишком большая плотность, стационарная фаза) показано ответное изменение содержимого их экзосом.2

Если цель вашего исследования - описание грузов экзосом в нормальных условиях, важно собрать эти микровезикулы в подходящее время.

Правильный выбор ротора для ультрацентрифуги

Работа на ультрацентрифуге совместного пользования может вызывать опасения. Это дорогое оборудование, и вы наверняка слышали страшные истории о людях, которые использовали неподходящие пробирки или неправильно перевели скорость вращения в ускорение, чем вызвали поломку инструмента, не говоря уже о потере ценных образцов.

Ультрацентрифугирование требует высокой точности не только при подготовке проб, но и при выборе ротора для выполнения задачи. Роторы с низким k-фактором - показателем, который зависит от угловой скорости вращения и радиуса ротора - обеспечивают наиболее эффективное дифференциальное центрифугирование исследуемых образцов.1

Например, бакетный ротор имеет большее различие между минимальным и максимальным радиусами, чем угловой. Это означает, что в угловом роторе пробы должны осветляться быстрее, а содержащиеся в них биочастицы – точнее разделяться в пределах градиента плотности в соответствии со своими изопикническими точками.

Следует помнить, что каждый ротор при использовании в конкретной центрифуге имеет свой k-фактор. И для каждой комбинации ротор/центрифуга этот показатель нужно рассчитывать заново.

Еще одной переменной, о которой следует помнить, является скорость вращения. Чтобы успешно выделить экзосомы с помощью дифференциального ультрацентрифугирования необходимо центрифугировать образцы при определенной скорости в течение определенного периода времени.

Воспользуйтесь онлайн-калькулятором Intellifuge, чтобы подобрать ротор, который обеспечит надлежащее осаждение исследуемых проб.

Приготовление градиента плотности

Density Gradient Ultracentrifuge

Градиенты плотности имеют важное значение для чистоты выделенных экзосом, поскольку для надежного отделения экзосом от частиц похожего размера (вирусов и небольших апоптотических телец) используется различие их плотности.

Традиционно градиенты плотности готовили из растворов сахарозы с возрастающей концентрацией. Однако в более современных протоколах для улучшенного разделения и сохранения размеров экзосом в изоосмотических условиях используют градиент йодиксанола.

Часто предлагаются и другие методы выделения экзосом, но по сравнению с ультрацентрифугированием в градиенте плотности ни один из них не дает лучших результатов по чистоте экзосом и разнообразию их содержимого.3

Поскольку для чистоты собранных в ультрацентрифуге экзосом градиент плотности имеет главное значение, важно обеспечить точное приготовление составляющих растворов, а также их аккуратное наслоение.

Автоматизированное дозирование жидкостей является естественным решением этих задач. Роботизированная лабораторная станция осторожно наносит слоями растворы йодиксанола/сахарозы для получения ступенчатого градиента плотности.

Определение размера и концентрации экзосом

После выделения экзосомы можно исследовать на предмет содержащихся в них грузов (белки, липиды, нуклеиновые кислоты и т. д.) или охарактеризовать иными способами для получения информации о родительских клетках. Одним из этапов характеризации, который можно автоматизировать, является определение размеров экзосом на основе отслеживания наночастиц.

Устройство для отслеживания наночастиц легко встраивается в процесс и дает возможность выполнить точный и воспроизводимый анализ распределения экзосом по размерам и концентрации в дилюенте.

Облегчение последующего анализа

В большинстве случаев главной целью выделения экзосом является не просто сбор, а исследование их грузов для лучшего понимания этой формы межклеточных взаимодействий. Ученые успешно выделили из экзосом ДНК,4 РНК5, 6 и белок7, 8 и использовали их для анализа ключевых компонентов и влияния небольших мессенджеров.

Некоторые методы такого анализа, например, секвенирование РНК, требуют постановки нескольких последовательных реакций. Автоматизация дозирования жидкостей поможет сделать это без ошибок и получить воспроизводимые результаты.

Другие методы, например ИФА, требуют приготовления планшетов, инкубации и возможностей для считывания планшетов. Все эти этапы можно выстроить в непрерывный технологический процесс с помощью гибкой автоматизации.

Выводы

Дифференциальное ультрацентрифугирование является эффективным и надежным методом выделения экзосом высокой чистоты. Многошаговый технологический процесс требует исключительной точности и воспроизводимости. Этого можно достичь с помощью автоматизации.

Список литературы

  1. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
  2. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., and Mittelbrun, M. Sorting it out: Regulation of Exosome Loading. Semin. Cancer Biol. (2014) 28:3-13. doi: 10.1016/j.semcancer.2014.04.009.
  3. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles. (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.
  4. Lazaro-Ibanez, E., Sanz-Garcia, A. Visakorpi, T., Escobedo-Lucea, C., Siljander, P., Ayuso-Sacido, A., et al. Different gDNA content in the subpopulations of prostate cancer extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles, and exosomes. Prostate. (2014) 74:1379-90. doi: 10.1002/pros.22853.
  5. Stevanato, L., Thanabalasundraram, L., Vysokov, N., and Sinden, J.D. Investigation of Content, Stoichiometry and Tarnsfer of miRNA from Human Neural Stem Cells Line Derived Exosomes. PLoS One. (2016) 11:e0146353. doi: 10.1371/journal.pone.0146353.
  6. San Lucas, F.A., Allenson, K., Bernard, V., Castillo, J., Kim, D.U., Ellis, K., et al. Minimally invasive genomic and transcriptomic profiling of visceral cancers by next-generation sequencing of circulating exosomes. Ann. Oncol. (2016) 27:635-41. doi: 10.1093/annonc/mdv604.
  7. Winston, C.N., Goetzl, E.J., Akers, J.C., Carter, B.S., Rockenstein, E.M., Galasko, D., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. (Amst). (2016) 3:63-72. doi: 10.1016/j.dadm.2016.04.001.
  8. Lasser, C., O-Neil, S.E., Shelke, G.V., Sihlbom, C., Hansson, S.F., Gho, Y.S., et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation. J. Transl. Med. (2016) 14:181. doi: 10.1186/s12967-016-0927-4.