SuperNova v428: новый яркий полимерный краситель для проточной цитометрии
Arunkumar Easwaran, Massimiliano Tomasulo, Boi Hoa San, Mukesh Mudgal, Sergei Gulnik | Beckman Coulter Inc., Майами, штат Флорида, США
Valérie Mallet Designe, Sylvain Monseaux | Beckman Coulter, Марсель, Франция
Введение
SuperNova v428 — это новый водорастворимый полимерный краситель, который возбуждается излучением фиолетового лазера (405 нм) и обладает исключительной яркостью. Это качество обусловлено высоким коэффициентом экстинкции (~3 млн л·моль-1·см-1) и квантовым выходом флуоресценции (~0,6) в фосфатном буфере. Максимум возбуждения этого полимера наблюдается при 414 нм, а его максимум излучения — при 428 нм (рис. 1), что можно обнаружить с помощью полосового фильтра 450/50 или аналогичного фильтра в проточном цитометре.
|
|
| Рисунок 1. Слева — спектры поглощения и излучения (λвозб. = 405 нм) красителя SuperNova v428 в PBS. Справа — раствор SuperNova v428 в PBS после освещения УФ-лампой при длине волны 365 нм. |
Синтез полимерных красителей SuperNova и конъюгация с антителами
Краситель SuperNova v428 получают путем полимеризации водорастворимых мономеров (как показано на рис. 2), при которой формируется флуоресцентная основа с высокой степенью конъюгации. Полученный полимер подвергается кэпированию с последующей активацией с использованием соответствующих функциональных групп. Активированные полимеры вступают в конъюгацию с антителами, а затем очищаются с помощью стандартной процедуры.
|
|
| Рисунок 2. Схема синтеза, активации и конъюгации полимера SuperNova v428. |
Конъюгаты полимерных красителей обычно проявляют тенденцию к значительному неспецифическому окрашиванию, например, при неспецифическом связывании с клетками, экспрессирующими Fc-рецепторы, в частности, моноцитами. Был определен и оптимизирован запатентованный состав, позволяющий минимизировать такое неспецифическое окрашивание и еще больше улучшить индекс окрашивания SuperNova v428.
|
|
| Рисунок 3. Окрашивание цельной крови CD22-SNv428 до (слева) и после (справа) введения добавок, предотвращающих неспецифическое окрашивание. Фон у моноцитов значительно снижается. |
Результаты проточной цитометрии
Краситель SuperNova v428 подвергали конъюгации с различными антителами и сравнивали с конъюгатами полимерных красителей PE, Pacific Blue и Brilliant Violet. При проточной цитометрии конъюгаты антитело-SuperNova v428 оказались более чем в 10 раз ярче красителя Pacific Blue; они также были более яркими, чем PE и BV 421. Неспецифическое окрашивание также было значительно меньше по сравнению с конъюгатами BV 421.
|
|
| Рисунок 4. Конъюгаты SuperNova v428 (с CD19, CD22 и CD25) в сравнении с конъюгатами BV421, PE и Pacific Blue при проточной цитометрии. Все конъюгаты SuperNova v428 были более яркими, чем вышеупомянутые доступные в продаже конъюгаты. Неспецифическое связывание было значительно меньше в случае конъюгатов SuperNova v428. |
Таблица 1. Индекс окрашивания лимфоцитов и MFI моноцитов (фон) при окрашивании нормальной цельной крови с использованием маркеров лимфоцитов, конъюгированных с SN v428, BV421, PE и Pacific Blue.
| Антитело | Флуорохром | Клон (Изотип) | Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) моноцитов (фон) |
| CD19 | SN v428 | 281 | 0,688 |
| BV421 | 191 | 1,533 | |
| PE | 246 | 0,805 | |
| Pacific Blue | 48 | 0,6 | |
| CD22 | SN v428 | 172 | 1,033 |
| BV421 | 123 | 1,476 | |
| PE | 136 | 0,716 | |
| Pacific Blue | 28 | 0,958 | |
| CD25 | SN v428 | 36 | 0,731 |
| BV421 | 14 | 2,021 | |
| PE | 24 | 1,052 | |
| Pacific Blue | 6 | 0,522 |
Выводы
Красители SuperNova — новое поколение полимерных красителей для применения в проточной цитометрии. Краситель SuperNova v428 обладает уникальными фотофизическими свойствами, благодаря которым при конъюгации с антителами образуются чрезвычайно яркие конъюгаты.
Запатентованный состав, включающий уникальные добавки, позволяет минимизировать неспецифическое окрашивание, чтобы улучшить индекс окрашивания и повысить достоверность результатов окрашивания при проточной цитометрии. Таким образом, конъюгаты SuperNova v428 особенно хорошо подходят для исследования малочисленных популяций и маркеров с низкой экспрессией.
Только для исследовательских целей. Не предназначены для использования в диагностических процедурах.
Pacific Blue является зарегистрированным товарным знаком компании Molecular Probes, Inc.