SuperNova v428: новый яркий полимерный краситель для проточной цитометрии

Arunkumar Easwaran, Massimiliano Tomasulo, Boi Hoa San, Mukesh Mudgal, Sergei Gulnik | Beckman Coulter Inc., Майами, штат Флорида, США
Valérie Mallet Designe, Sylvain Monseaux
| Beckman Coulter, Марсель, Франция

Введение

SuperNova v428 — это новый водорастворимый полимерный краситель, который возбуждается излучением фиолетового лазера (405 нм) и обладает исключительной яркостью. Это качество обусловлено высоким коэффициентом экстинкции (~3 млн л·моль-1·см-1) и квантовым выходом флуоресценции (~0,6) в фосфатном буфере. Максимум возбуждения этого полимера наблюдается при 414 нм, а его максимум излучения — при 428 нм (рис. 1), что можно обнаружить с помощью полосового фильтра 450/50 или аналогичного фильтра в проточном цитометре.

Спектры поглощения и излучения (λвозб. = 405 нм) красителя SuperNova v428 в PBS. Раствор SuperNova v428 в PBS после освещения УФ-лампой при длине волны 365 нм.

Рисунок 1. Слева — спектры поглощения и излучения (λвозб. = 405 нм) красителя SuperNova v428 в PBS. Справа — раствор SuperNova v428 в PBS после освещения УФ-лампой при длине волны 365 нм.

Синтез полимерных красителей SuperNova и конъюгация с антителами

Краситель SuperNova v428 получают путем полимеризации водорастворимых мономеров (как показано на рис. 2), при которой формируется флуоресцентная основа с высокой степенью конъюгации. Полученный полимер подвергается кэпированию с последующей активацией с использованием соответствующих функциональных групп. Активированные полимеры вступают в конъюгацию с антителами, а затем очищаются с помощью стандартной процедуры.

Схема синтеза, активации и конъюгации полимера SuperNova v428

Рисунок 2. Схема синтеза, активации и конъюгации полимера SuperNova v428.

Конъюгаты полимерных красителей обычно проявляют тенденцию к значительному неспецифическому окрашиванию, например, при неспецифическом связывании с клетками, экспрессирующими Fc-рецепторы, в частности, моноцитами. Был определен и оптимизирован запатентованный состав, позволяющий минимизировать такое неспецифическое окрашивание и еще больше улучшить индекс окрашивания SuperNova v428.

Окрашивание цельной крови CD22-SNv428 до (слева) и после (справа) введения добавок, предотвращающих неспецифическое окрашивание. Фон у моноцитов значительно снижается.

Рисунок 3. Окрашивание цельной крови CD22-SNv428 до (слева) и после (справа) введения добавок, предотвращающих неспецифическое окрашивание. Фон у моноцитов значительно снижается.

Результаты проточной цитометрии

Краситель SuperNova v428 подвергали конъюгации с различными антителами и сравнивали с конъюгатами полимерных красителей PE, Pacific Blue и Brilliant Violet. При проточной цитометрии конъюгаты антитело-SuperNova v428 оказались более чем в 10 раз ярче красителя Pacific Blue; они также были более яркими, чем PE и BV 421. Неспецифическое окрашивание также было значительно меньше по сравнению с конъюгатами BV 421.

Конъюгаты SuperNova v428 (с CD19, CD22 и CD25) в сравнении с конъюгатами BV421, PE и Pacific Blue при проточной цитометрии.

Рисунок 4. Конъюгаты SuperNova v428 (с CD19, CD22 и CD25) в сравнении с конъюгатами BV421, PE и Pacific Blue при проточной цитометрии. Все конъюгаты SuperNova v428 были более яркими, чем вышеупомянутые доступные в продаже конъюгаты. Неспецифическое связывание было значительно меньше в случае конъюгатов SuperNova v428.

Таблица 1. Индекс окрашивания лимфоцитов и MFI моноцитов (фон) при окрашивании нормальной цельной крови с использованием маркеров лимфоцитов, конъюгированных с SN v428, BV421, PE и Pacific Blue.

Антитело Флуорохром Клон (Изотип) Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) моноцитов (фон)
CD19 SN v428 281 0,688
BV421 191 1,533
PE 246 0,805
Pacific Blue 48 0,6
CD22 SN v428 172 1,033
BV421 123 1,476
PE 136 0,716
Pacific Blue 28 0,958
CD25 SN v428 36 0,731
BV421 14 2,021
PE 24 1,052
Pacific Blue 6 0,522

Выводы

Красители SuperNova — новое поколение полимерных красителей для применения в проточной цитометрии. Краситель SuperNova v428 обладает уникальными фотофизическими свойствами, благодаря которым при конъюгации с антителами образуются чрезвычайно яркие конъюгаты.

Запатентованный состав, включающий уникальные добавки, позволяет минимизировать неспецифическое окрашивание, чтобы улучшить индекс окрашивания и повысить достоверность результатов окрашивания при проточной цитометрии. Таким образом, конъюгаты SuperNova v428 особенно хорошо подходят для исследования малочисленных популяций и маркеров с низкой экспрессией.

Только для исследовательских целей. Не предназначены для использования в диагностических процедурах.
Pacific Blue является зарегистрированным товарным знаком компании Molecular Probes, Inc.

Полезные ссылки

Задайте нам вопрос