Применение ультрацентрифугирования для очистки и характеризации биомолекул

Тип материала: постер
Akash Bhattacharya,1 Ross VerHeul,2 Eric Von Seggern,1 Stephen Otts,2 Beckman Coulter, Inc., 1Loveland, CO & 2 Indianapolis, IN, USA

Введение

При вращении в ультрацентрифугах на образцы действуют центробежные силы в диапазоне 100 000–1 000 000 × g. Под воздействием этих сил молекулы образца разделяются в зависимости от физических свойств (например, размер, молекулярная масса, плотность, анизотропность). Благодаря этому метод ультрацентрифугирования используется начиная от очистки и определения параметров низкомолекулярных полимеров вплоть до мульти-мегадальтоновых протеиновых комплексов и органелл.

Препаративное ультрацентрифугирование

Preparative Ultracentrifugation 

Дифференциальное ультрацентрифугирование

  1. Частицы распределяются по размеру и молекулярной массе (коэффициент седиментации, S).
  2. За счет многократного осаждения центрифугированием можно достичь итеративного обогащения.
  3. Метод идеален для разделения популяций молекул в широком диапазоне.
Density Gradient Ultracentrifugation (DGUC) 

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности (DGUC)

  1. Растворимые частицы разделяют в слоях жидкости разной плотности (градиент плотности).
  2. При зональном центрифугировании частицы распределяются с разной скоростью в зависимости от значения коэффициента седиментации (S) и времени.
  3. Изопикническое центрифугирование не зависит от временного фактора. При применении этого метода частицы распределяются на основании различимой плавучей плотности частиц.
  4. Метод идеально подходит для высокоэффективного разделения мелких частиц со схожими физическими свойствами.

Пример протокола очистки плазмидной ДНК методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности

  1. Плазмидную ДНК можно выделить из бактерий различными способами.
  2. Приведенный ниже протокол иллюстрирует обычную экстракцию щелочным лизисом и очистку методом центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl) с бромидом этидия.
  3. Для очистки плазмидной ДНК также могут использоваться и более новые градиенты плотности (например, йодиксанол/OptiPrep) и ДНК-зонды (например, DAPI и GelGreen).
Example Workflow for DGUC Purification of Plasmid DNA 

CENT-4959PST02.19