Разделение наночастиц золота в градиенте плотности с использованием центрифуги Avanti JXN и бакетного ротора JS-24.15

Скачать PDF

Asmita Patel, Josh Robinson | Beckman Coulter, Inc.

Аннотация

В последнее десятилетие использование наночастиц золота становится все более популярным в области биомедицинских наук, особенно при визуализации опухолей1, фототепловой терапии2,3 и металл-усиленной флуоресценции. Используемые для таких задач наночастицы должны быть высококачественными, с монодисперсными размерами и соотношениями сторон.

В настоящих указаниях по применению приведена удобная методика выделения наночастиц золота из полидисперсного образца в градиенте плотности на центрифуге Avanti JXN.

Введение

Использование золотых стержневидных наночастиц (AuNR) является весьма перспективным направлением биомедицинской визуализации. AuNR характеризуются отчетливо выраженными пикаии поглощения в видимой и ближней инфракрасной области спектра благодаря плазмонному эффекту. Соотношение сторон AuNR напрямую определяет длину волны пика.

Для применения в области биомедицинской визуализации важно иметь оптически и физически чистые образцы золотых стержневидных наночастиц. Однако процесс синтеза AuNR обычно сопровождается появлением некоторых посторонних примесей в виде золотых наносфер (которые не вытягиваются) и неоптимальных AuNR с немного отличающимися соотношениями сторон.

Поскольку AuNR и золотые наносферы (AuNS) имеют один и тот же состав элементов, одинаковое покрытие поверхности в результате синтеза (в большинстве случаев - поверхностно-активное вещество цетилтриметиламмоний бромид-ЦТАБ (CTAB)) и сходные размеры, их разделение представляет собой большую проблему.

Центрифугирование в градиенте плотности (DGC) прекрасно подходит для разделения наночастиц с одинаковыми размерами, но с различной плотностью из-за незначительных сдвигов в соотношении площади поверхности/объема.

В рамках данного исследования мы работали с двумя образцами чистых AuNR: один – с соотношением сторон 41 (10 нм x 41 нм) и плазмоном 800 нм; другой – с соотношением сторон 2,4 (25 нм х 60 нм) и плазмоном 650 нм. Образцы сначала смешивали, а затем разделяли методом одноэтапного DGC на высокоскоростной центрифуге Avanti JXN-30 с бакетным ротором JS-24.15.

По результатам оптической спектроскопии было установлено, что разделенные образцы AuNR оказались такими же чистыми, как и исходные образцы до смешивания.

Материалы

Регагент Производитель Кат. номер
Наночастицы золота, 10 нм Sigma 716820
Наночастицы золота, 25 нм Sigma 771686
Сахароза Sigma 84097
CTAB Sigma H9151

Протокол

Центрифугирование золотых наночастиц в градиенте плотности. Стержневые наночастицы золота (AuNR) диаметром 10 нм (плазмонный пик 808 нм) и диаметром 25 нм (плазмонный пик 650 нм) концентрировали до 0,05 мл путем осаждения 3 мл каждого образца в микроцентрифуге Microfuge 16 от Beckman Coulter при 10 000 х g в течение 5 мин и последующего ресуспенидрования в воде с 0,01 М CTAB.

Градиент плотности готовили вручную в 15 мл центрифужных пробирках из полипропилена (кат. № 361707), как указано в таблице ниже:

Номер слоя Состав слоя градиента Объем
1 0,01 М CTAB, 10% сахароза 2 мл
2 0,01 М CTAB, 15% сахароза 4 мл
3 0,01 М CTAB, 20% сахароза 4 мл
4 0,01 М CTAB, 25% сахароза 4 мл

Оба сконцентрированных образца AuNR обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин (с помощью ультразвукового диспергатора Branson MI800), а затем смешивали и наслаивали поверх градиента плотности.

Пробирки с градиентом и образцами центрифугировали 15 мин при 10 750 x g и 25°C в высокоскоростной центрифуге Avanti JXN-30 от Beckman Coulter с бакетным ротором JS‑24.15. Режимы ускорения и торможения были установлены на 3.

После центрифугирования материал поделили на фракции по 300 мкл. С помощью микропланшетного сканера Paradigm отбирали фракции с плазмонными пиками 808 нм и 650 нм.

Смену буфера осуществляли путем центрифугирования отобранных фракций на микроцентрифуге Microfuge 16 при 10 000 х g в течение 5 мин и ресуспендирования полученного осадка AuNR в 0,01 M CTAB. Для тщательной промывки осадка этот этап повторяли три раза, а по окончании ресуспендировали материал в 250 мкл 0,01 M CTAB.

Спектры поглощения образцов до смешивания, после смешивания и после разделения исследовали с помощью спектрофотометра DU 800.

Результаты и обсуждение

После анализа чистоты образцов методом абсорбционной спектроскопии (Рис. 1а) мы смешали их вместе и провели повторный анализ спектра поглощения (Рис. 1b).

Чистоту несмешанных образцов AuNR проверяли путем сравнения соотношения продольного плазмонного пика (800 нм и 650 нм для образцов AuNR 10 нм и AuNR 10 нм, соответственно) с поперечным плазмонным пиком (515 нм для обоих образцов).

Для чистых образцов AuNR 10 нм отношение коэффициентов поглощения при 650 нм и 515 нм составило 2,32. Для чистых образцов AuNR 25 нм такое отношение при 800 нм и 515 нм составило 3,85.

После фракционирования центрифугированной смеси и сбора оптически чистых образцов мы провели повторный анализ их спектра поглощения (Рис. 2). Соотношение пиков 650 нм/515 нм для очищенного образца AuNR 10 нм оказалось равным 1,91 и почти таким же высоким, как для чистого образца в начале эксперимента.

Для очищенного образца AuNR 25 нм соотношение пиков 800 нм/515 нм составило 4,54. Это значение даже выше, чем для чистого образца AuNR 25 нм в начале эксперимента. Это указывает на то, что исходный чистый образец AuNR 25 нм содержал примесь AuNS.

graph 1 - metal nanorod    graph 2 - metal nanorod
Рис. 1a. Спектры поглощения образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм до их смешивания.   Рис. 1b. Спектр поглощения смеси образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм.
graph 3 - metal nanorod    image- metal nanorod
Рис. 2. Спектры поглощения образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм после разделения методом центрифугирования в градиенте плотности.   Рис. 3. Фотографии пробирки с материалом до (A) и после (B) разделения AuNR 25 нм и AuNR 10 нм центрифугированием в градиенте плотности.

Список литературы

  1. Popovtzer R et al. Targeted gold nanoparticles enable molecular CT imaging of cancer. Nano Letters. 8.12; 4593–4596: (2008).
  2. Huang X et al. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers in Medical Science. 23.3; 217–228: (2008).
  3. O'Neal D P et al. Photo-thermal tumor ablation in mice using near infrared-absorbing nanoparticles. Cancer Letters. 209.2; 171–176 (2004).
  4. 4. Hong G et al. Near-Infrared-Fluorescence-Enhanced Molecular Imaging of Live Cells on Gold Substrates. Angewandte Chemie International Edition. 50.20; 4644–4648: (2011).

Заполните форму ниже, чтобы связаться с нами