Система адаптеров g-Max предоставляет новые возможности при работе на ультрацентрифугах Beckman Coulter

Указания по применению

Chad Schwartz, Ph.D., Randy Lockner, M.S., Randy Pawlovich | Beckman Coulter, Inc.

Использование системы адаптеров g-Max для роторов может оптимизировать процесс центрифугирования за счет:

  • Большего разнообразия рабочих объемов образцов;
  • Повышения эффективности процесса центрифугирования;
  • Использования запаивающихся пробирок.

Использование пробирок малых объемов

Благодаря уникальному подходу к обеспечению фиксации пробирки в гнезде ротора использование системы g-Max позволяет центрифугировать малые объемы проб в вертикальных, угловых и бакетных роторах без уменьшения развиваемой центробежной силы.

В системе используются запатентованные пробирки Quick-Seal1 с колоколообразным верхом и устанавливающиеся сверху спейсеры. В отличие от обычных адаптеров втулочного типа, верхние спейсеры системы g-Max располагаются на пробирке, что позволяет центрифугировать образец на максимальном расстоянии от оси вращения, таким образом увеличивая эффективность процесса.

Повышение эффективности

Для процессов осаждения повышение эффективности означает уменьшение времени центрифугирования. За счет сокращения длины пути осаждения частиц технология g-Max может существенно сократить время эксперимента.

Запаивающиеся пробирки

Пробирки Quick-Seal используются в бакетных, вертикальных, околовертикальных и угловых роторах. Они могут быть выполнены в различных объемах и формах: с куполообразным верхом, с колоколообразным верхом, с коническим дном.

За счет надежной герметизации использование пробирок Quick-Seal особенно актуально при работе с патогенными и потенциально опасными образцами. Заполненные пробирки герметизируются с помощью ручного запаивателя. Они не требуют крышек и стандартных манипуляций как при работе с обычными пробирками, что сокращает время на подготовку к центрифугированию.

Угловые роторы

Использование системы g-Max при осаждении в угловых роторах позволяет существенно сократить время работы.

На Рисунке 1 изображено сравнение в гнездах ротора системы g-Max, пробирки в стандартном адаптере и пробирки без адаптера. Длина пути осаждения частиц в пробирке при использовании системы спейсеров g-Max в угловых роторах меньше, чем при использовании полноразмерных пробирок, а максимальный радиус при этом остается неизменным.

Рисунок 1. Преимущества применения системы g-Max в угловых роторах по сравнению со стандартными адаптерами и работой без адаптеров.

Таким образом удается сохранить значения максимального ускорения и сократить время осаждения. При этом использование стандартного адаптера приводит к уменьшению максимального радиуса, а, как следствие, и к уменьшению максимального ускорения и увеличению времени центрифугирования.

Показателем эффективности ротора или пробирки является k-фактор, который позволяет оценить время t (в часах), необходимое для осаждения частиц с известным коэффициентом седиментации s (в единицах Сведберга): t = k/s. Чем значение k-фактора ниже, тем выше эффективность ротора, так как значение k-фактора прямо пропорционально времени прогона.

В Таблице 1 представлены примеры того, как система g-Max дает возможность увеличить производительность при работе с роторами Type 70.1 Ti и Type 90 Ti.

Из сравнения значений k-факторов видно, что использование адаптеров g-Max позволяет сократить время прогона примерно в 3-4 раза. Кроме того, многие стандартные адаптеры втулочного типа нельзя использовать на максимальных скоростях вращения из-за проблем со стабильностью.

Также система g-Max может обеспечить большую эффективность даже по сравнению с полноразмерными пробирками без дополнительных адаптеров. Например, k-фактор ротора Type 90 Ti с пробирками 13,5 мл - 25, а с пробирками на 6,3 мл - 14.

Таблица 1. Сравнение производительности роторов в зависимости от используемой системы адаптеров.

Тип адаптера Объем (мл) Макс. скорость
(об/мин)
Макс. ускорение
(x g)
k-фактор
Type 70.1 Ti
13,5 70 000 450 000 36
Стандартный 6,5 50 000 212 000 60
g-Max 6,3 70 000 450 000 24
Type 90 Ti
13,5 90 000 694 000 25
Стандартный 6,5 50 000 197 000 69
g-Max 6,3 90 000 694 000 14

Вертикальные роторы

За счет своей высокой эффективности вертикальные роторы широко востребованы для проведения центрифугирования в градиенте плотности, например, при выделении плазмидной ДНК.

Благодаря наличию системы g-Max для всех вертикальных роторов Beckman Coulter доступны пробирки двух или более видов. Хотя в случае вертикальных роторов использование адаптеров g-Max не приводит к сокращению времени работы, но возможность использовать пробы меньшего объема также является очень полезной, так как использование пробирок меньшего объема может позволить сохранить критически важные образцы или избежать эффекта разбавления (Рисунок 2).

Бакетные роторы

Одним из существенных преимуществ использования системы g-Max в бакетных роторах является вторичная герметизация. Так как пробирки Quick-Seal укупориваются запаиванием, их использование особенно полезно при работе с патогенными и радиоактивными образцами. А существенное сокращение длины пути осаждения за счет использования верхнего адаптера значительно уменьшает время экспериментов, в которых высота полос градиента не имеет большого значения.

Пробирки меньшей длины предоставляют большую гибкость в выборе рабочих объемов, сокращают время прогона, а также уменьшают требуемое количество градиентного материала (Рисунок 3).

Figure 2   Figure 3
Рисунок 2. При использовании в вертикальных роторах система g-Max предоставляет больший выбор объемов проб.   Рисунок 3. Использование системы g-Max в бакетных роторах наиболее эффективно.
 

Обзор преимуществ g-Max в зависимости от типа ротора

Применение системы g-Max обладает преимуществами по сравнению со стандартными решениями для всех типов роторов, но наиболее существенно они проявляются для угловых и бакетных роторов. В Таблице 2 указаны преимущества для разных типов роторов.

Таблица 2. Преимущества использования системы g-Max.

Тип ротора Разнообразие объемов Сокращение времени
центрифугирования
Запаивающиеся
пробирки
Вертикальный  
Угловой
Бакетный

Пример оптимизации протокола центрифугирования: очистка экзосом

Количество публикаций и исследований, связанных с изучением экзосом, существенно растет в последние годы. Экзосомы - это маленькие везикулы диаметром около 30-100 нм, которые могут выделяться разными типами клеток, выполнять множество различных функций, в том числе, например, играть существенную роль в развитии онкологических заболеваний.2-6

Усовершенствованный и более эффективный протокол выделения экзосом может внести вклад в развитие данной области науки.7 В настоящей работе описана эффективная методика выделения высокоочищенных фракций экзосом с использованием пробирок g-Max.

Как правило, протокол выделения экзосом включает следующие этапы. На первых 2-3 этапах с помощью низкоскоростного центрифугирования удаляют дебрис и мертвые клетки. Далее с помощью ультрацентрифуги при ускорении 100 000 x g и времени прогона 90 мин осаждают экзосомы и контаминирующие белки.8

Образовавшийся осадок ресуспендируют в буфере (обычно PBS), наносят поверх градиента плотности и центрифугируют в течение 18 часов.9 Полученные фракции собирают и осаждают двумя отдельными прогонами при ускорении 100 000 x g в течение 1 часа. Далее их характеризуют с помощью таких методов, как электронная микроскопия, динамическое светорассеяние, вестерн-блоттинг, и определяют степень чистоты и размеры полученных экзосом.

Описанная методика довольно трудоемка, но позволяет получить экзосомы высокой степени чистоты, правильных размеров и формы.

Мы разработали и представили протокол очистки и выделения очистки экзосом с применением технологии g-Max, которая позволяет сохранить значения максимального ускорения при уменьшении пути осаждения частиц и, как следствие, сэкономить общее время на проведение эксперимента (Рисунок 4).

Рисунок 4. Сравнение протоколов, показывающее экономию 1 часа при использовании технологии g-Max.

Оптимизированный протокол

В эксперименте по реализации оптимизированного протокола использовали клетки из замороженного материала. С помощью анализатора Vi-Cell Beckman Coulter определяли их количество, размер и жизнеспособность.

После получения фракции с высоким уровнем жизнеспособности 25 мл образца клеток (6 x 105 клеток/мл) добавляли в 50 мл конические пробирки, помещали в ротор SX4750A центрифуги Allegra X-15R и центрифугировали в течение 10 мин при 750 x g. Образовавшийся супернатант собирали и центрифугировали сначала при 2 000 x g в течение 20 мин, а затем еще раз при 10 000 x g в течение 20 минут на ультрацентрифуге Optima XPN с использованием ротора SW 32 Ti и пробирок Quick-Seal объемом 15 мл для удаления клеточного дебриса.

Далее вновь собранный супернатант пропускали через 0,22 мкм фильтр и центрифугировали при 100 000 x g в течение 40 мин в пробирках Quick-Seal на 15 мл c использованием адаптеров g-Max. После данной процедуры супернатант декантировали, а осадок ресуспендировали в буфере 1 x PBS.

Рисунок 5. Подготовленный градиент Opti-Prep, для визуализации полос которого использовали пищевой краситель.

Для получения градиента плотности (Рисунок 5, Таблица 3) использовали лабораторную автоматизированную станцию Biomek 4000 Beckman Coulter. Раствор с ресуспендированными экзосомами (объемом 1 мл) наслаивали поверх градиента и центрифугировали при 100 000 x g и 4˚C в течение 18 часов.

Фракции объемом 500 мкл отбирали сверху пробирок и объединяли с каждой третьей фракцией до общего объема 1,5 мл. Далее образцы помещали в пробирки Quick-Seal объемом 1,5 мл с адаптерами g-Max и центрифугировали при ускорении 100 000 x g и температуре 4˚C на ультрацентрифуге Optima MAX-XP в течение 45 мин.

Наконец, осадок ресуспендировали в буфере PBS и центрифугировали при 100 000 x g в течение дополнительных 45 мин в тех же пробирках Quick-Seal на 1,5 мл с использованием адаптеров g-Max для удаления остатков градиента Opti-Prep. Конечный осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера PBS и замораживали при -20˚C перед проведением анализа.

Таблица 3. Состав градиента Opti-Prep, использованного в экспериментах.

Номер слоя Плотность (г/мл) Объем (мл) % йодиксанола
(0,25 М сахарозы, pH 7.5)
1 1,160 40
2 1,147 3 20
3 1,133 3 10
4 1,120 2 5

На Рисунке 6 представлены результаты измерения размера частиц в образцах, полученных по двум методикам, с помощью анализатора DelsaMax Beckman Coulter. Все восемь фракций по 1,5 мл были охарактеризованы методом DLS с одинаковыми предустановленными параметрами для обоих протоколов - ранее опубликованного и оптимизированного с применением адаптеров g-Max.

Рисунок 6. Характеризация ресуспендированных осадков, полученных центрифугированием в градиенте плотности методом DLS. Красные точки соответствуют частицам, полученным с помощью "протокола g-Max", черные - с помощью "стандартного протокола". В обоих случаях присутствуют частицы диаметром 30 - 100 нм, соответствующие по размерам экзосомам.

Фракции 1-12 имели белковые примеси, о чем свидетельствуют пики диаметром не менее 10 нм (данные не представлены). Фракции 16–24 также содержали примеси белков и частички диаметром около 250 нм, которые, вероятно, соответствовали более крупным молекулам или клеточному дебрису (данные не представлены).

Однако фракции 13–15 из обоих экспериментов (опубликованного и оптимизированного) содержат частицы диаметром около 30 - 100 нм, что говорит о содержании экзосом. Таким образом, оба протокола позволяют выделять экзосомы в градиенте плотности и одинаково эффективно их очищать. Полученные в данной работе данные демонстрируют возможность использования системы g-Max для уменьшения времени экспериментов с одинаково точными и воспроизводимыми результатами.

Совместимость адаптеров g-Max с роторами и пробирками Beckman Coulter

В ниже перечислены роторы для настольных и ультрацентрифуг Beckman Coulter, а также пробирки, которые совместимы с адапетрами g-Max. 

Объем (мл) Размеры (мм) Артикул Роторы*
Полипропиленовые пробирки Quick-Seal
1,5 11x25 344624 SW 60 Ti, TLA-120.2, MLA-130, MLA-150, TLS-55
2,0 11x32 344625 SW 60 Ti, TLA-120.2, MLA-130, MLA-150, TLS-55
2,0 13x25 345829 Types 100 Ti, 50.4 Ti, 50.3, NVT 100, NVT 90, NVT 65.2, VTi 90, VTi 65.2, SW 50, TLA-110, TLA-100.3 MLS-50
3,5 13x30 349621 Types VTi 90, 100 Ti, TLA-110, TLA-100.3
3,5 14x25 355870 SW 41 Ti, SW 40 Ti
4,2 16x32 356562 Types 90 Ti, 70.1 Ti, 65, 40, SW 32.1 Ti, SW 28.1, MLA-80, MLN-80, MLA-55
5,1 13x51 362248 Types VTi 90, 100 Ti
5,9 14x47 355537 SW 41 Ti, SW 40 Ti
6,3 16x44 345830 Types 90 Ti, 80 Ti, 70.1 Ti, 65, 50 Ti, 50, 40, NVT 65, VTi 65.1, SW 32.1 Ti, SW 28.1, MLA-80, MLN-80, MLA-55
8,0 16x57 344621 Types 50, NVT 65, VTi 65.1 SW 32.1 Ti, SW 28.1, MLA-80, MLN-80
10,0 16x67 344622 Types 90 Ti, 80 Ti, 70.1 Ti, 65, 50 Ti, 40, NVT 65, VTi 65.1, SW 32.1 Ti, SW 28.1, MLA-55
15,0 25x38 343664 Types 70 Ti, 60 Ti, 55.2 Ti, 50.2 Ti, VTi 50, SW 32 Ti, SW 28, MLA-50
27,0 25x64 343665 Types 70 Ti, 60 Ti, 55.2 Ti, 50.2 Ti, 42.1, VTi 50, SW 32 Ti, SW 28, MLA-50
33,5 25x83 344623 Types 70 Ti, 60 Ti, 55.2 Ti, 50.2 Ti, SW 32 Ti, SW 28
Полипропиленовые пробирки Quick-Seal konical
1,3 11x35 358655 SW 60 Ti
4,0 14x48 358650 SW 41 Ti
8,4 25x38 358652 SW 32 Ti, SW 28
22,5 25x76 358654 SW 32 Ti, SW 28
28,0 25x83 358651 SW 32 Ti, SW 28
Пробирки Quick-Seal Ultra-Clear
15,0 25x38 344324 Types 70 Ti, 60 Ti, 55.2 Ti, 50.2 Ti, VTi 50, MLA-50
27,0 25x64 344323 Types 70 Ti, 60 Ti, 55.2 Ti, 50.2 Ti, VTi 50, MLA-50
Полипропиленовые пробирки konical
1,5 11x35 358117 SW 60 Ti

Список литературы

  1. U.S. Patent Nos. 4,301,963; 4,304,356; 4,290,550; British Patent No. 2,021,982; Canadian Patent No. 1,132,509; Japanese Patent No. 1,469,153; Italian Patent No. 1,121,772.
  2. Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, Altevogt P. Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunol Lett. 107(2); 102–8: (2006). doi:10.1016/j.imlet.2006.09.005
  3. Duijvesz D et al. Exosomes as biomarker treasure chests for prostate cancer. European urology. 59.5; 823–831: (2011).
  4. Jero M, Valenti R, Huber V, Filipazzi P, Parmiani G, Fais S, et al. Tumour-released exosomes and their implications in cancer immunity. Cell Death Differ. 15(1); 80–8: (2007). doi:10.1038/sj.cdd.4402237
  5. Yang C, Robbins PD. The roles of tumor-derived exosomes in cancer pathogenesis. Clin Dev Immunol. 2011; 1–11: (2011). doi:10.1155/2011/842849
  6. Azorsa DO. The genomic and proteomic content of cancer cell-derived exosomes. Front Oncol. 2; 38: (2012). doi:10.3389/fonc.2012.00038/abstract
  7. Simpson RJ, Mathivanan S. Extracellular microvesicles: the need for internationally recognised nomenclature and stringent purification criteria. J Proteomics Bioinform. 5: (2012).
  8. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3.22: (2006). doi:10.1002/0471143030
  9. Tauro BJ et al. Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation, and immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derived exosomes. Methods. 56.2; 293–304: (2012).

Заполните форму ниже, чтобы связаться с нами