Характеризация препаратов инсулина методом аналитического ультрацентрифугирования

Указания по применению

Chad Schwartz Ph.D. и Dean Clodfelter, M.S. | Beckman Coulter, Inc.

Аннотация

Инсулин - хорошо изученный лекарственный препарат, используемый для лечения диабета. Большое количество различных форм инсулина исследовано с целью разработки препаратов с оптимальным временем доставки, соответствующем требованиям лечения заболевания. Кроме того, был разработан ряд аналогов инсулина, таких как инсулин Glarine и инсулин LysPro (Humalog), для немедленного использования (короткого действия) или наоборот длительного действия.

После выхода ряда нормативных документов о биоаналогах многие фармацевтические компании начали активно разрабатывать различные версии инсулинов для удовлетворения нужд пациентов по всему миру. Биодоступность данных препаратов зависит не только от первичной структуры биомолекул, но и от их организации. Для анализа структуры инсулина более высоких уровней при стандартных условиях находит применение метод аналитического ультрацентрифугирования (AUC).

В данной работе метод AUC использовали для изучения влияния концентрации инсулина, катионов цинка и ЭДТА (агента, хелатирующего цинк) на образование мономеров, димеров и гексамеров эталонного стандарта человеческого инсулина Фармакопеи США (USP). Показано влияние концентрации ЭДТА на образование мономеров, димеров и гексамеров в присутствии катионов цинка. В работе представлены сведения об использовании аналитической ультрацентрифуги ProteomeLab XL-I Beckman Coulter для характеризации и разработки биофармацевтических препаратов.

Введение

По данным Американской диабетической ассоциации в 2012 году 29,2 млн американцев или 9,4% населения страдали диабетом 1 или 2 типов. В 2010 году заболевание занимало 7-е место среди причин смерти в США и унесло жизни 69 071 людей1.

Поскольку организм заболевших не способен самостоятельно вырабатывать достаточное количество инсулина, стандартным методом лечения диабета 1 типа является ежедневная терапия препаратами инсулина. Обычно пациентам с диабетом 1 типа требуется делать несколько инъекций инсулина каждый день во время еды.

Однако даже при должном контроле и правильном введении инъекции препаратов инсулина не воспроизводят естественный временной профиль действия нативного инсулина, поэтому интенсивно разрабатываются аналоги препарата с улучшенной эффективностью.

Большая часть исследований в настоящее время направлена на изучение зависимости профиля действия инсулина от его стехиометрии в условиях готовой лекарственной формы и после попадания в человеческий организм путем инъекции.

Биофармацевтические компании постоянно используют различные методы для измерения размеров частиц и характеризации их гетерогенности в растворе. Метод AUC позволяет проанализировать размеры частиц, гетерогенность и коэффициенты трения путем численного решения фундаментального уравнения Ламма, которое описывает седиментацию частиц в растворе.

В ранних работах представлены данные об использовании метода AUC для оценки влияния состава препарата на коэффициенты седиментации инсулина2,3, но нет упоминаний об оценке влияния цинка и хелатирующего агента на олигомеризацию молекул инсулина.

Материалы

Двухосновный фосфат натрия, хлорид цинка, ЭДТА и глицерин производства Fisher Scientific. Гидроксид натрия производства Fluka, соляная кислота BDH Chemicals. Эталонный стандарт человеческого инсулина (USP) был приобретен у Fisher Scientific.

Аналитическая ультрацентрифуга ProteomeLab XL-I, двухсекторные ячейки для проведения экспериментов по скоростной седиментации, кварцевые окошки, ротор An 60 Ti, ротор An 50 Ti производства Beckman Coulter, Inc.

Методы

Характеризация образцов инсулина различной концентрации без примесей. Инсулин ресуспендировали до 50 мг/мл в 0,04 N HCl и разбавили до соответствующих концентраций. Также приготовили эталонный буферный раствор без инсулина. Далее по 420 мкл эталона и образца помещали в двухсекторную ячейку ротора An 60 Ti и уравновешивали при 20˚C более 1 часа. Образцы сканировали в течение 4 часов при 60 000 об/мин и 20˚C на длине волны поглощения 280 нм в непрерывном режиме.

Характеризация образцов инсулина в виде лекарственной формы. Инсулин ресуспендировали до 50 мг/мл в 0,04 N HCl, разбавили до соответствующих концентраций и приготовили препараты с добавлением 150 мкМ ZnCl2, 16 мг/мл глицерина, 1,9 мг/мл двухосновного фосфата натрия и 2,2 мМ NaOH. Также приготовили эталонный буферный раствор без инсулина. Далее по 420 мкл эталона и образца помещали в двухсекторную ячейку ротора An 60 Ti и уравновешивали при 20˚C более 1 часа. Образцы сканировали в течение 4 часов при 60 000 об/мин и 20˚C на длине волны поглощения 280 нм в непрерывном режиме.

Характеризация образцов инсулина в зависимости от концентрации цинка. Инсулин ресуспендировали до 50 мг/мл в 0,04 N HCl и разбавили до концентрации 4 мг/мл добавлением ZnCl2 (различные концентрации), 16 мг/мл глицерина, 1,9 мг/мл двухосновного фосфата натрия и 2,2 мМ NaOH. Также приготовили эталонный буферный раствор без инсулина. Далее по 420 мкл эталона и образца помещали в двухсекторную ячейку ротора An 60 Ti и уравновешивали при 20˚C более 1 часа. Образцы сканировали в течение 4 часов при 60 000 об/мин и 20˚C на длине волны поглощения 280 нм в непрерывном режиме. После окончания центрифугирования ротор с образцами оставляли в центрифуге под вакуумом и температуре 20˚C на 15 дней. Далее ячейки с образцами интенсивно встряхивали и осуществляли повторный прогон при аналогичных условиях.

Характеризация образцов инсулина в зависимости от концентрации ЭДТА. Инсулин ресуспендировали до 50 мг/мл в 0,04 N HCl и разбавили до концентрации 2 мг/мл добавлением 150 мкМ ZnCl2, 16 мг/мл глицерина, 1,9 мг/мл двухосновного фосфата натрия и 2,2 мМ NaOH. Затем, добавив в смесь различные количества ЭДТА, подготовили серию препаратов и проинкубировали их в течение 20 минут при комнатной температуре. Также приготовили эталонный буферный раствор без инсулина. Далее по 420 мкл эталона и образца помещали в двухсекторную ячейку ротора An 50 Ti и уравновешивали при 20˚C более 1 часа. Образцы сканировали в течение 5 часов при 50 000 об/мин, 20˚C на длине волны поглощения 280 нм в непрерывном режиме.

Анализ седиментационных данных. Полученные экспериментальные данные обрабатывали в программе SEDFIT 14.7 g4 (www. analyticalultracentrifugation.com). Данные по абсорбции проанализировали с точки зрения дифференциального распределения коэффициента седиментации c(s) с использованием максимального доверительного интервала энтропии 0,68. Во всех экспериментах значения среднеквадратичного отклонения составляли от 0,0016 до 0,0093 единиц поглощения. Парциальный удельный объем молекул инсулина рассчитывали по аминокислотной последовательности в программе SEDNTERP5 (http://sednterp.unh.edu); значения плотности ρ и вязкости η различных буферов также были рассчитаны в SEDNTERP. Использовалась модель c(s), в которой коэффициент трения f/fo не учитывался, а парциальный удельный объем подбирался. Данные были выгружены в GUSSI (http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) и построены в координатах c(s) с минимальным ограничением в 0.3 S.

Дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) инсулинов различной концентрации в буфере 0,04 N HCl
 
Русунок 1. Дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) инсулинов различной концентрации в буфере 0,04 N HCl.

Результаты и обсуждение

В первую очередь мы провели эксперименты по скоростной седиментации трех серий образцов различных концентраций на основе эталонного USP человеческого инсулина в буфере 0,04 N HCl с использованием двухсекторных ячеек.

Результаты обработки полученных данных в программе SEDFIT показали наличие пика в районе 1.2 S для всех трех образцов (Рис. 1). Значения c(s) приведены в ненормированном виде для демонстрации снижения сигнала при уменьшении концентрации. Полученный коэффициент седиментации 1.2 S с наибольшей вероятностью говорит о наличии мономерной формы инсулина, что согласуется с данными Pohl, et.al.1 и поведением мономера2,3.

Далее анализировали стандартные готовые препараты инсулина1, также методом скоростной седиментации. В данном случае значения коэффициента s20,w инсулина составили 2.95 – 3.1 S, однако при концентрации 4,0 мг/мл наблюдался пик 2.12 S со значением c(s) 8,3% (Рис. 2).

Новый пик (2.95 - 3.1 S), по всей видимости, соответствовал димерной форме инсулина. Примечательно, что белок диссоциировал при самых высоких значениях его концентрации. Это может говорить о том, что олигомеризация молекул инсулина не зависит от концентрации, но может зависеть от состава компонентов раствора.

Нормированное дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) препаратов инсулина различной концентрации:
 
Рисунок 2. Нормированное дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) препаратов инсулина различной концентрации: 0,25 мг/мл (черная линия), 1,0 мг/мл (синяя линия), 4,0 мг/мл (зеленая линия).

Для того чтобы изучить этот эффект, исследовали влияние концентрации цинка в препаратах на коэффициенты седиментации инсулина. При фиксированной концентрации инсулина увеличение концентрации цинка способствовало образованию гексамера с коэффициентом седиментации около 3.0 S (Рис. 3A). Таким образом, было показано, что наличие цинка является критическим для образования гексамеров.

При высоких концентрациях инсулина, если концентрация цинка не находится на уровне насыщения, образуются другие олигомерные формы инсулина, такие как димеры. Для определения зависимости этого эффекта от времени аналогичные по составу образцы оставляли под вакуумом при 20˚C в течение 15 дней и делали прогон в аналогичных условиях второй раз.

Полученные результаты оказались одинаковыми (Рис. 3B). Это позволяет предположить, что гексамер стабилен в течение по меньшей мере 15 дней после приготовления препаратов.
Figure 3. Sedimentation velocity normalized c(s) of concentration titration of formulated Insulin.   Нормированное распределение коэффициентов седиментации c(s) препаратов инсулина при различных концентрациях цинка
 
Рисунок 3. Нормированное распределение коэффициентов седиментации c(s) препаратов инсулина при различных концентрациях цинка: 0,25 мг/мл (черная линия), 1,0 мг/мл (синяя линия) и 4,0 мл/мл (зеленая линия).

Наконец, для подтверждения роли катионов цинка в образовании гексамерных форм инсулина в состав препаратов вводили раствор ЭДТА в качестве хелатирущего агента. При проведении данной серии экспериментов значения концентраций инсулина и цинка оставляли неизменными, а концентрацию ЭДТА варьировали. После добавления ЭДТА растворы инкубировали в течение 20 минут.

Результаты показали, что при увеличении концентрации ЭДТА гексамеры инсулина диссоциировали на мономеры и димеры (Рис. 4). При концентрации ЭДТА 75 мкМ около 11% гексамерных комплексов диссоциировали до мономеров (Таблица 1). А при концентрации 150 мкМ в мономерную форму диссоциировали еще 15% комплексов, что соответствует пику с сигналом 26,4%.

При 300 мкМ ЭДТА гексамеры полностью диссоциировали до мономеров (60%) и димеров (40%). При 600 мкМ ЭДТА соотношение мономерной и димерной формы составляли 68% и 32% соответственно.

Распределение коэффициентов седиментации c(s) препаратов инсулина с различной концентрацией ЭДТА  
Конц. ЭДТА Гексамер Димер Мономер
0 мкм ЭДТА 100% (3.201 S) N/A N/A
75 мкм ЭДТА 88,88% (3.015 S) N/A 11,11% (1.373 S)
150 мкм ЭДТА 73,59% (2.949 S) N/A 26,41% (1.400 S)
300 мкм ЭДТА N/A 40,63% (2.258 S) 59,37% (1.52 S)
600 мкм ЭДТА N/A 31,99% (2.262 S) 68,01% (1.551 S)
 
Рисунок 4. Распределение коэффициентов седиментации c(s) препаратов инсулина с различной концентрацией ЭДТА.
  Таблица 1. Олигомерный состав препаратов инсулина в зависимости от концентрации ЭДТА.

Выводы

Инсулин - хорошо изученный лекарственный препарат, который производится многими фармацевтическими предприятиями по всему миру и используется для лечения диабета вот уже более 80 лет.

В настоящее время биофармацевтические компании прилагают большие усилия для создания новых производных инсулина и его лекарственных форм для улучшения эффективности препаратов, их методов введения и характеристик по времени воздействия на организм.

При разработке аналогов инсулина в будущем необходимо будет учитывать влияние вспомогательных веществ, таких как цинк, на состояние готового лекарственного средства. Влияние таких факторов могут быть исследованы различными аналитическими методами.

Традиционно степень агрегации препаратов человеческого инсулина анализируют с помощью стандартного фармакопейного метода гель-фильтрационной хроматографии (SEC). Данный метод позволяет количественно оценить ковалентные агрегаты, такие как димеры, которые образуются в результате реакции конденсации свободных аминов на N-концах и/или свободных лизинов.

Дополнительная ковалентная агрегация может возникать в результате разрушения и преобразования дисульфидных связей. Однако этот метод не позволяет измерить отношение нековалентных агрегатов, таких как гексамеры, к мономерным формам молекул инсулина, так как нековалентные агрегаты разрушаются в ходе пробоподготовки или проведения анализа SEC.

Как показано в данной работе, метод AUC может быть использован для оценки содержания нековалентных агрегатов. Нами был продемострирован прямой подход к характеризации биформацевтических препаратов с различными олигомерными формами белковых молекул, требующий минимальной пробоподготовки.

Большинство распространенных сегодня методов, таких как гель-фильтрационная хроматография (SEC), требуют дополнительных манипуляций с образцом, например, разведений или взаимодействий с матрицей, что может повлиять на характер агрегации.

Кроме того, хоть SEC и является более распространенным методом для оценки агрегации, диапазон измерения молекулярных масс методом AUC составляет от нескольких сотен Да до 109 Да, что превышает известные возможности аналитической SEC7.

Наконец, AUC позволяет получить разнообразную количественную информацию о свойствах белковых молекул, таких как молекулярная масса, форма, коэффициенты сольватации8, данные о посттрансляционных модификациях9 и конформационных флуктуациях10 при концентрациях около 40-50 мг/мл11.

Таким образом, метод AUC - это прямой, не требующий стандартов, метод, независимый по отношению к другим традиционным методам как SEC, который позволяет характеризовать биоаналоги, изучать агрегацию, а также может быть использован для оценки качества выпускаемой продукции и разработки готовых лекарственных форм7.

†Результаты, полученные с помощью программного обеспечения и представленные в данном разделе, не гарантированы. Подробная информация об ограничении ответственности приведена в описании каждого программного продукта.

Список литературы

  1. American Diabetes Association: http://www.diabetes.org/diabetes-basics/statistics/
  2. Richards, J.P., Stickelmeyer, M.P., Flora, D.B., Chance, R.E., Frank, B.H., DeFelippis, M.R. Self association properties of monomeric insulin analogs under formulation conditions. Pharmaceutical Research. (1998) 15(9): 1434 1441.
  3. Pohl, R., Hauser, R., Li, M., De Souza, E., Feldstein, R., Seibert, R., Ozhan, K., Kashyap, N., Steiner, S. Ultra rapid absorption of recombinant human insulin induced by zinc chelation and surface charge masking. J Diabetes Science & Technology. (2012) 6(4): 755 763.
  4. Schuck P. Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys. J. (2000) 78:1606–19.
  5. Cole J.L., Lary J W, Moody T P and Laue T M Analytical ultracentrifugation: sedimentation velocity and sedimentation equilibrium. Methods Cell Biol. (2008) 84:143–79.Fredericq E, Neurath H. The interaction of insulin with thiocyanate and other anions. the minimum molecular weight of insulin. J Am Chem Soc. (1950) 72:2684–91.
  6. Jeffrey P.D., Coates J.H. An equilibrium ultracentrifuge study of the self association of bovine insulin. Biochemistry. (1966) 5(2):489–98.
  7. Berkowitz, S.A., Philo, J.S. Characterizing Biopharmaceuticals using analytical ultracentrifugation. Biophysical Characterization of Proteins in Developing Pharmaceuticals. (2014) 9:211-260. DOI:10.1016/B978-0-444-59573-7.00009-9.
  8. Schuck, P. A model for sedimentation in inhomogeneous media. I. Dynamic density gradients from sedimenting co-solutes. Biophys Chem. (2004) 108(1-3):187-200.
  9. Moores, S.C., Jason, L., Ausio, J. The elusive structural role of ubiquitinated histones. Biochem Cell Biol. (2002) 80(3):311-9.
  10. Hansen, J.C., Kreider, J.L., Demeler, B., Fletcher, T.M. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. (1997) 12(1):62-72.
  11. Philo, J.S., Maluf, N.K. New approaches to investigating the self-association and colloidal stability of protein pharmaceuticals at high concentrations. http://www.ap-lab.com/WCBP 2015 poster.pdf.

Заполните форму ниже, чтобы связаться с нами