Ускорение ваших геномных исследований с автоматизацией пробоподготовки на Biomek

Biomek i-Series для автоматизированного выделения РНК из тканей набором RNAdvance Tissue

Введение

В наборе Agencourt RNAdvance Tissue для выделения тотальной РНК (микроРНК и мРНК) применяется запатентованная технология обратимой твердофазной иммобилизации (SPRI) нуклеиновых кислот на парамагнитных частицах Agencourt компании Beckman Coulter. После лизиса ткани, РНК иммобилизируется на магнитных частицах, что способствует отделению РНК с помощью магнитного поля (рисунок 1). Такой способ выделения позволяет автоматизировать процесс применения набора, поскольку при этом не требуется ни вакуумной фильтрации, ни центрифугирования. Кроме того, протокол может выполняться как для 96-луточных планшетов, так и в формате одной пробирки, что обеспечивает гибкую схему рабочего процесса. В данном методическом пособии мы рассмотрим автоматизацию набора RNAdvance Tissue на Biomek i5 Multichannel 96 Genomics Workstation.

Автоматизация Agencourt RNAdvance Tissue на платформе Biomek позволяет:

  • стандартизировать рабочий процесс для получения более надежных результатов;
  • снизить вероятность дорогостоящих ошибок;
  • сократить время ручного труда и повысить производительность;
  • наладить работу готовых методов в максимально короткий срок;
  • получать компетентную поддержку по реагентике, автоматизации и методикам от одного производителя.

Решение: Biomek i5 Multichannel 96 Genomics Workstation

Biomek i-5 с многоканальным дозирующим модулем 1200 мкл

Система характеризуется надежностью и эффективностью, что позволяет быть уверенным в результатах и экономить его время по сравнению с работой вручную.

  • 96-и канальный дозирующий модуль на 300 мкл или 1200 мкл с диапазоном дозирования 1–300 мкл и 1–1200 мкл соответственно
  • Технология Enhanced Selective Tip позволяет работать с любым количеством образцов
  • 25 positions
  • Встроенный гриппер с боковым захватом и вращением на 360 ̊
  • 25 позиций на рабочем столе
  • Орбитальные шейкеры и элементы Пелтье для пробоподготовки
  • Дополнительный корпус

Автоматизированный метод

Рабочий процесс выделения РНК с Beckman Coulter Agencourt RNAdvance Tissue

Рисунок 1. Рабочий процесс выделения РНК сBeckman Coulter Agencourt RNAdvance Tissue

Описание основного процесса
С обработкой ДНКазой Без обработки ДНКазой
Подготовка реагентов и приборов* 15 мин 15 мин
Метод Agencourt RNAdvance Tissue 1 ч 36 мин 2 ч 16 мин
Всего 1 ч 51 мин 2 ч 31 мин

* Без учета времени оттаивания реагентов, препарирования, лизиса ткани и гомогенизации

Таблица 1. Расчетное время рабочего цикла при применении набора Agencourt RNAdvance Tissue на станции Biomek i5 Multichannel 96 Genomics, 1–96 образцов

Лабораторная станция Biomek i5 Multichannel 96 Genomics продемонстрировала способность выделять РНК из 96 образцов менее чем за 2 часа (таблица 1). Применение программного модуля Biomek Method Launcher упрощает реализацию метода и уменьшает количество ошибок при настройке метода.

1. Программный модуль Biomek Method Launcher (BML)

BML — это простой интерфейс для запуска методов. Он позволяет пользователям удаленно следить за ходом выполнения метода. Также предусмотрена опция ручного контроля, чтобы при необходимости скорректировать процесс.

Программный модуль Biomek Method Launcher – удобный интерфейс для запуска метода

Рисунок 2. Программный модуль Biomek Method Launcher предлагает удобный интерфейс для запуска метода

2.Программный модуль Method Options Selector (MOS)

MOS позволяет выбирать варианты обработки планшетов и задавать число образцов, чтобы добиться максимальной гибкости, адаптации и простоты выполнения метода.

Выбор числа образцов и варианта их обработки в программном модуле Biomek Method Options Selector

Рисунок 3. В программном модуле Biomek Method Options Selector указывается число образцов и варианты их обработки

3.Программный модуль Guided Labware Setup (GLS)

GLS на основании данных, введённых в MOS рассчитывает необходимые количества пластика и реагентов и предоставляет оператору пошаговую инструкцию по расстановке рабочего стола.

Модуль Guided Labware Setup отображает объемы реагентов и помогает пользователю определить правильную конфигурацию рабочего стола

Рисунок 4. Программный модуль Guided Labware Setup отображает объемы реагентов и помогает пользователю определить правильную конфигурацию рабочего стола

План эксперимента

Было отделено примерно по 10 мг ткани замороженной мышиной почки (3 повторности), печени (2 повторности) и мозга (2 повторности). РНК выделялась с помощью как ручного, так и автоматизированного протокола с использованием набора RNAdvance Tissue. Количество и качество образцов РНК оценивали с применением спектрофотометра NanoDrop 2000 TM (Thermo Fisher Scientific), набора для анализа РНК Quant-iT™ RiboGreen® (Thermo Fisher Scientific), биоанализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (набор Agilent RNA 6000 Nano) и метода количественной ПЦР в режиме реального времени (набор KAPA SYBR® Fast One-Step qRT-PCR Master Mix (2 шт.), фланкирующий транскрипт интрона актина B, реакция выполнялась в трех повторностях).

Результаты

Высокое качество РНК требуется во многих случаях ее последующего применения. Чтобы в полной мере определить различия РНК, выделяемой по ручному и автоматизированному протоколам, мы оценивали качество образцов РНК с применением множества методов.

Чтобы оценить чистоту нуклеиновой кислоты, прибор NanoDrop рассчитывает отношение показателя поглощения нуклеиновой кислоты к показателю поглощения загрязнителей. При выполнении как ручного, так и автоматизированного протокола обработки образцов были получены удовлетворительные отношения A260/A280 (1,8–2,2) и приемлемые отношения A260/A230 (> 1,7 в общем; таблица 2).

Метод
Ткань
NanoDrop RiboGreen
260/280 260/230 Конц. (нг/мкл) Выход (нг)
Ручной Почка 2,13 1,67 72,257 2890,29
Ручной Почка 2,13 1,45 59,842 2393,70
Ручной Почка 2,16 1,45 63,450 2537,96
Ручной Печень 2,05 0,42 18,652 746,10
Ручной Печень 2,04 0,56 102,726 4109,02
Ручной Мозг 2,01 0,72 3,5350 141,40
Ручной Мозг 1,93 0,84 29,803 1192,11
Автоматизированный Почка 2,03 1,72 43,130 1725,20
Автоматизированный Почка 2,09 1,69 38,925 1557,01
Автоматизированный Почка 2,1 1,58 40,384 1615,36
Автоматизированный Печень 2,17 1,86 62,386 2495,44
Автоматизированный Печень 2,17 1,95 73,161 2926,45
Автоматизированный Мозг 2,01 1,24 20,149 805,97
Автоматизированный Мозг 1,98 1,35 14,329 573,17

Таблица 2. Kонцентрация, выход и чистота РНК по результатам, полученным с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 и набора для анализа РНК Quant-iT™ RiboGreen®.

В анализе РНК с помощью набора Quant-iT RiboGreen для количественного определения РНК применяют РНК-специфичный краситель. Выход РНК в нашем автоматизированном методе был сопоставим с выходом при ручном выделении (таблица 2).

Числа целостности РНК (RIN), рассчитанные с помощью биоанализатора Agilent 2100 Bioanalyzer, учитывают не только отношение 28S и 18S рРНК, но и электрофоретический след РНК, обеспечивая надежную оценку качества РНК. Как ручной, так и автоматизированный методы продемонстрировали превосходные показатели RIN (рисунок 5). Для различных тканей показатель RIN был ниже при выполнении автоматизированного протокола обработки образцов (рисунок 5, почка: станд. откл. при ручной и автоматизированной обработке — 0,7 и 0,5 соответственно; мозг: станд. откл. при руч-ной и автоматизированной обработке — 0,9 и 0,1 соответственно). Показатели RIN варьировались в зависимости от типа ткани как для ручного, так и для автоматизированного протокола, что свидетельствует о необходимости применения тканеспецифичных протоколов лизиса и гомогенизации (рисунок 5).

Образцы РНК мыши, полученные с помощью ручного (a) и автоматизированного (b) методов

Рисунок 5. Образцы РНК мыши, полученные с помощью ручного (a) и автоматизированного (b) методов, были проанализированы на приборе Agilent Bioanalyzer 2100.

Чтобы продемонстрировать пригодность выделенной РНК для последующего применения, мы провели количественную ПЦР в режиме реального времени. РНК, выделенная с помощью обоих методов, была амплифицирована в диапазоне Ct 15–20, что свиде-тельствует о ее превосходном качестве (рисунок 6).

Графики амплификации количественной ПЦР в режиме реального времени (зависимость флуоресценции от числа циклов) для матриц РНК в случае ручного (a) и автоматизированного (b) методов

Рисунок 6. Графики амплификации количественной ПЦР в режиме реального времени (зависимость флуоресценции от числа циклов) для матриц РНК в случае ручного (a) и автоматизированного (b) методов. Концентрация матрицы РНК 50 нг/мкл; X: положительный контроль 200 нг/мкл; y: нет контроля обратной транскрипции; z: нет контроля матрицы

Заключение

Мы продемонстрировали автоматизацию применения набора Agencourt RNAdvance Tissue на лабораторной станции Biomek i5 Multichannel 96 Genomics. Качество и количество РНК, выделенной по автоматизированному протоколу, было сопоставимо с аналогичными показателями РНК, выделенной вручную. Автоматизация позволила быстро и эффективно выделить высококачественную РНК с незначительными различиями между разными типами тканей. Показатели выделения нуклеиновых кислот были одинаковыми не для всех типов тканей. По этой причине автоматизированный протокол, как и ручной, можно легко модифицировать, чтобы добиться оптимальных условий (например, лизис и гомогенизация) для конкретного типа ткани.

 

Автоматизированные лабораторные станции Biomek не предназначены и не утверждены для диагностики заболеваний или других состояний. Данные, представленные в настоящем документе, были получены в процессе разработки.