Автоматизированный анализ посева и роста клеток

Сводная информация

  • Автоматизированное разведение и посев клеток линии CHO
  • Подтвержденная согласованность посева и визуализации анализов
  • Автоматизированный анализ методом XTT для определения линейности по относительному количеству клеток

Применение в клеточных направлениях требует проведения согласованных процессов посева клеток и пробоподготовки, чтобы можно было точно соотнести клеточные изменения с воздействием на клетки в ходе экспериментов. Подтверждение согласованного посева можно получить при визуализации лунок или в ходе суррогатных анализов, в частности, с использованием наборов для анализа жизнеспособности клеток методом XTT. Подобные анализы также можно выполнять для обнаружения различий в росте клеток, например, при скрининге цитотоксичности или скрининге для оптимизации среды. Автоматизация может повысить согласованность посева клеток и пробоподготовки, снижая при этом вероятность ошибок. На нижеприведенном рисунке мы демонстрируем, как лабораторная станция Biomek i5 (рисунок 1) применялась для серийного разведения суспензии клеток, посева полученных в результате клеток и их подготовки к анализу методом XTT.

Во избежание загрязнения микроорганизмами крайне важно, чтобы культивирование клеток и проведение анализов осуществлялось в стерильных условиях. В лабораторную станцию закрытого типа Biomek i5 можно добавить воздушный фильтр HEPA (рисунок 1) вместе со стерильными пипеточными наконечниками для поддержания стерильности во время манипуляций с клетками на рабочем столе.

Лабораторная станция Biomek i5 Span-8, корпуса оборудованы HEPA-фильтрами 

Рисунок 1. Лабораторная станция Biomek i5 Span-8, корпуса оборудованы HEPA-фильтрами

Суспензию клеток линии СНО (2 × 105 клеток/мл) добавили в лунку планшета с глубокими лунками и на станции Biomek i5 выполнили последующую серию разведений в соотношении 1 : 2. По 100 мкл получившихся суспензий высевали на планшет с лунками в трех повторностях. Пипетирование было оптимизировано, чтобы предотвратить попадание пузырьков в лунки и гарантировать равномерное распределение клеток и газообмен во всей лунке. Клетки инкубировали при 37 °C, 5 % CO2 в течение 4 ч перед анализом количества клеток на многорежимной платформе SpectraMax® i3x Multi-Mode с применением цитометра SpectraMax MiniMax 300 с возможностью визуализации. На рисунке 2A приведено среднее количество клеток для каждого разведения, а на рисунке 2B изображен график зависимости полученного количества клеток от расчетного количества при посеве. Высокое значение R2(0,9996) свидетельствует о согласованности процессов разведения и посева клеток.

Число клеток по результатам визуализации 

Рисунок 2. Число клеток по результатам визуализации. С помощью цитометра SpectraMax MiniMax для каждой лунки в трех повторностях для каждого разведения было получено по четыре светлопольных изображения. A) Среднее количество клеток и коэффициент вариации для лунок в трех повторностях. B) График зависимости среднего количества клеток от расчетного количества клеток при посеве. Планки погрешностей на графике соответствуют стандартным отклонениям в трех повторностях. Превосходная линейность (R2 = 0,9996) свидетельствует о согласованных процессах серийного разведения и посева.

По 50 мкл реагента XTT добавили в лунки в трех повторностях и поместили обратно в инкубатор на 4 ч. Значения поглощения при 475 нм были получены с помощью платформы SpectraMax i3x Multi-Mode и использованы для определения общего количества клеток в каждой лунке. На рисунке 3A показана согласованность значений количества клеток и добавляемых реагентов в трех повторностях (CV < 2 %), а на рисунке 3B приведена линейность (R2 = 0,9991), которая подтверждает согласованное разведение клеток, наблюдаемое при визуализации.

Анализ количества клеток методом XTT 

Рисунок 3. Анализ методом XTT. Реагент XTT добавляли к клеткам через четыре часа после посева, а затем в течение еще четырех часов проводили инкубацию. A) Средние показания поглощения и коэффициенты вариации (CV) для лунок в трех повторностях. B) График зависимости поглощения от количества клеток при посеве (планки погрешностей = стандартное отклонение). Линейность (R2 = 0,9991) и низкая вариация (коэффициенты вариации < 2 %) свидетельствуют о высокой надежности анализа методом XTT.

Эта работа демонстрирует способность надежно выполнять посев клеток и анализ их роста методом XTT с превосходными показателями согласованности. В случаях применения, требующих повышенной производительности, например при клеточном скрининге, можно использовать прибор Biomek серии i с многоканальной насадкой и (или) интегрировать инкубатор и анализаторы, необходимые для обеспечения полного рабочего процесса.

Автоматизированные лабораторные станции Biomek не предназначены и не утверждены для диагностики заболеваний или других состояний. Данные, представленные в настоящем документе, были получены в процессе разработки.