Характеризация вирусных векторов

Разработка средств доставки генетического материала в клетки - актуальная задача клеточной и генной терапии. Многие специалисты выбирают в качестве такого средства аденоассоциированные вирусы (AAV), поскольку их капсиды можно модифицировать для транспортировки молекул, обладающих с терапевтическим свойствами.

Векторы на основе рекомбинантных аденоассоцированных вирусов (rAAV) открывают многоообещающие перспективы в области генной терапии. 

пустой капсид, неполный капсид, полный капсид, конечная цель, определение характеристик вирусных векторов методом аналитического ультрацентрифугирования

Однако  исследователи обязательно должны определять, какая доля вирусных капсидов является интактной и сколько интактных вирусных капсидов являются полными. Это играет решающее значение для успеха терапии.

Вирусные частицы, которые не содержат полного целевого терапевтического гена, вряд ли будут оказывать терапевтическое действие. Вместо этого эти неполные капсиды могут вызывать нежелательные реакции, такие как иммуногенный ответ.

Классические методы анализа вирусных частиц в растворе, например, динамическое светорассеяние (ДРС) или высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), можно использовать для определения таких характеристик rAAV, как гетерогенность и агрегация. Однако они не обладают достаточным разрешением для количественной оценки гомогенности и нагрузки вирусных частиц. При создании векторных препаратов на основе rAAV для клинического применения, достижение высокого разрешения измерений всегда вызывает трудности.

Как известно исследователям в области генной терапии, когда на ранних этапах разработки продукта ставки очень высоки, быстрое получение отрицательного результата приобретает особую важность. В отличие от других технологий, внедрение аналитического ультрацентрифугирования позволяет создавать векторы rAAV для клинического применения.

Каково главное препятствие? Отсутствие метода количественного определения с высоким разрешением для контроля терапевтического качества с учетом:

  • Гомогенности;
  • Чистоты;
  • Консистенции продукта;
  • Целостности вириона.

Идеальное решение: анализ в растворе методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC).

Как выяснили исследователи из компании Genethon, благодаря возможности проведения безматричного анализа векторных препаратов на основе rAAV независимо от серотипа и трансгена AUC позволяет:

  • Определять состояние или гомогенность вирусного микросообщества;
  • Проводить эмпирический количественный анализ агрегации;
  • Определять загрязнение субчастицами;
  • Проводить количественный анализ массы для точной оценки генетической полезной нагрузки.

Просмотрите этот вебинар и узнайте, как Кристин Ле Бек из компании Genethon и ее исследовательская группа успешно применяли аналитическое ультрацентрифугирование для изучения характеристик векторов scAAV и ssAAV — в частности, определяли гомогенность и нагрузку вирусных частиц.

Аналитическая ультрацентрифуга для характеризации вирусных векторов

Аналитическая ультрацентрифуга Optima AUC

Optima AUC

Аналитическая ультрацентрифуга Optima AUC нового поколения часто используется для контроля качества вирусных векторов и определения нагрузки капсидов аденоассоциированных вирусов. 

Полезные ссылки

Вебинар: "Аналитические методы для количественной оценки пустых капсид и полных вирионов аденоассоциированных векторов"

 

Подходы, применяемые в генной терапии, обычно требуют больших количеств аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов. В настоящее время лишь немногие производственные процессы могут обеспечить высокий титр и большой объем препарата. Количественное содержание AAV векторов обычно устанавливается с помощью титриметрических методов, основанных либо на количественном определении ДНК (вирусный геном), либо на экспрессии трансгенов после трансдукции клеток (инфекционный геном). Однако производственные партии AAV векторов обычно представляют собой гетерогенную смесь пустых капсид (т. е. не содержащих ДНК) и полных вирионов (т. е. содержащих ДНК). Поэтому следует учитывать, что пустые капсиды в финальном препарате представляют собой родственные примеси, которые могут повлиять на профиль иммуногенности продукта при применении высоких доз пациентами. Установить соотношение между полными и пустыми капсидами AAV можно с помощью различных косвенных методов. Количественное определение полных вирионов осуществляется с использованием технологии на основе количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Общее содержание вирусных частиц можно оценить с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), спектрометрического анализа, ионообменной хроматографии или электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Однако эти методы имеют ограничения и применимы не ко всем серотипам без проведения дополнительного исследования. Используя подход на основе аналитического ультрацентрифугирования, мы разработали методику одновременного количественного определения в образце пустых и полных частиц AAV, а также промежуточных частиц, содержащих фрагментированный или неполный геном вектора. Мы применили этот метод к партиям AAV различных серотипов с несколькими размерами трансгена при использовании разных технологий производства. Представлено несколько примеров характеризации AAV векторов, которые подтверждают возможность использования аналитического ультрацентрифугирования в качестве стандартного метода для контроля качества получаемых AAV и стабильности производственного процесса.

База знаний

Virus Purification Workflow – Centrifugation Highlights Centrifuge to harvest cells containing virus
Analytical Ultracentrifugation - Macromolecule Characterization in Solution (Biopharma) Beckman Coulter delivered the first AUC sample characterization tool to the scientific community powering discoveries