Automated, high-throughput and low-cost RT-qPCR methods for SARS-CoV-2 surveillance testing using the Echo 525 Liquid Handler

Профессор Андреа Крисанти   «Станция дозирования Echo 525 была неотъемлемой частью нашей лаборатории для контрольного тестирования на коронавирус SARS-CoV-2. Мы обнаружили, что бесконтактная станция Echo 525 (tip-less) обеспечивает очень надежные данные с высокой чувствительностью для количественной ПЦР с обратной транскрипцией при объеме 5 мкл в диапазоне концентраций 2,1–200 копий/мкл.»

Профессор Андреа Крисанти, профессор микробиологии в Университете Падуи

Введение

Обнаружение коронавирусной инфекции 2019 (COVID-19), также известной как SARS-CoV-2, в Ухане (Китай) вызвало тревогу во всём мире [1]. Из-за этого смертельно опасного и очень заразного вируса весь мир был вынужден принять серьезные меры, поскольку число подтвержденных случаев заражения непрерывно растет с момента первого сообщения о заболевании. Китайское правительство предупредило о необходимости принятия международных усилий по борьбе с этой вспышкой заболевания. Профессор Андреа Крисанти [2] из Университета Падуи немедленно отреагировал на возникшую необходимость проводить многочисленные анализы и начал применять высокопроизводительный, автоматизированный и недорогой метод количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) для исследования тысяч образцов РНК из мазков, взятых в регионе Венето на севере Италии. 

Станция акустического дозирования Echo 525Станция дозирования Echo 525 — автоматизированная акустическая система дозирования жидкостей без использования наконечников от компании Beckman Coulter Life Sciences стала неотъемлемой частью этих высокопроизводительных и бюджетных исследований. Исследования методом ОТ-кПЦР возможно успешно проводить в уменьшенном до 5 мкл объеме в 384-луночных планшетах вместо 25 мкл в 96-луночных планшетах, благодаря высокой воспроизводимости и точности (до 25 нл), обеспечиваемой станцией Echo 525 Для реакции в 5 мкл использовали 1 мкл образца РНК, выделенной из мазков из носа, и 4 мкл заранее приготовленной смеси для ОТ-кПЦР, включая праймер и зонды. Уменьшение объема смеси для проведения ОТ-кПЦР имеет существенно важное значение, поскольку позволяет использовать меньшее количество реагентов с сохранением высокого предела обнаружения (ПО) на уровне 2,1 копий/мкл для одного образца. 

«В наших руках станция Echo позволила сократить время выдачи результата и время ручного труда на 92 % и 75 % соответственно, а также снизить затраты на реагенты для ОТ-кПЦР на 80 %. Более того, отсутствие необходимости в пластиковых наконечниках в корне изменило положение дел в нашей лаборатории, так как спрос на наконечники в условиях пандемии очень велик».

Андреа Крисанти - профессор микробиологии в Университете Падуи

Тотальные нуклеиновые кислоты выделяли из образцов мазков (объёмом 200 мкл), взятых из носоглотки, и элюировались в конечном объеме 100 мкл с помощью системы MagNA Pure 96. Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 осуществлялось с помощью внутреннего метода ОТ-кПЦР в реальном времени, который был создан в соответствии с протоколом, праймерами и зондами, разработанными Корманом и соавт. (Corman et al. [3]); мишенями в нем являются гены белка оболочки (E) (E_Sarbeco_F, E_Sarbeco_R, E_Sarbeco_P1) и РНК-зависимой РНК-полимеразы SARS-CoV-2 (RdRp: RdRp_SARSr-F, RdRp_SARSr-R, RdRP_SARSr-P1 и RdRp_SARSr-P2).

Рисунок 1. Рабочий процесс анализа нагрузки вирусной РНК в лаборатории проф. Крисанти

Рисунок 1. Рабочий процесс анализа нагрузки вирусной РНК в лаборатории проф. Крисанти

С помощью данного метода группа смогла исследовать до 5000 образцов в день, сократив время выдачи результата до 15 минут по сравнению с 3 часами при постановке реакции в 384-луночных планшетах. Кроме того, поскольку станция Echo создана на основе акустической технологии без применения наконечников, сокращается использование одноразовых наконечников, что критически важно по причине высокого спроса на наконечники в условиях пандемии SARS-CoV-2.

 

Тесты для сравнения станции дозирования Echo 525 и автоматизированной станции дозирования с применением наконечников

Семь образцов РНК низкой концентрации, отобранных из экстрактов мазков из носа, были исследованы параллельно с помощью станции Echo 525 и станции дозирования с применением наконечников (исследование проведено в 10 повторах). 

Идентификатор пробы Ct (станция дозирования с применением наконечников, 25 мкл, быстрая система для проведения ПЦР в реальном времени 7900HT) Среднее значение Ct для 10 повторностей
(Echo 525, 5 мкл, система для проведения ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 5)
Стандартное отклонение для 10 повторов для станции Echo 525
1 35 37 0,3
2 36 37 0,4
3 37 37 0,3
4 35 36 1,0
5 39 35 1,0
6 35 36 1,1
7 31 32 0,4

Таблица 1. Сравнение значений Ct при проведении ОТ-кПЦР с помощью двух разных методов при объеме 25 и 5 мкл.

Тот же самый тип сравнения двух станций дозирования был расширен для сопоставления схемы с четырьмя 96-луночными планшетами с образцами на станции дозирования с применением наконечников (25 мкл) и схемы с образцами в 384-луночном планшете (5 мкл) на станции Echo 525. Также были включены четыре образца положительного контроля (РНК из рибонуклеазы P человека) и 25 холостых проб в качестве отрицательного контроля. Результаты сравнения значений Ct показали следующее:

  • 327 образцов без нагрузки вирусной РНК в обеих системах;
  • 15 образцов с аналогичной нагрузкой вирусной РНК в обеих системах; значения Ct составляли от 17 до 35;
  • в 13 образцах наблюдалась вирусная нагрузка только при анализе с помощью прибора Echo 525 в 384-луночном формате и термоциклера QuantStudio 5. Из этих 13 образцов:
      • В восьми образцах наличие вирусной нагрузки было подтверждено другими методами.
      • Пять образцов не были проконтролированы.

Сравнение двух наборов данных показывает, что постановка ОТ-кПЦР в 5 мкл с использованием станции Echo 525 в 384-луночном формате не приводит к потерям выявления образцов с вирусной нагрузкой.

Сравнение ПО в реакциях в 5 мкл и 25 мкл

Результаты сравнения ПО в реакциях в 5 мкл и 25 мкл:

  • 0,82 копий/мкл для реакции в 25 мкл в 96-луночном планшете для ПЦР с использованием быстрого термоциклера для ПЦР в реальном времени 7900HT при анализе 5 мкл образца выделенной РНК;
  • 2,1 копий/мкл для реакции в 5 мкл в 384-луночном планшете для ПЦР с использованием термоциклера QuantStudio 5 при анализе 1 мкл образца выделенной РНК.

ПО оценивали по анализу 32 повторов образцов РНК с 10 различными концентрациями при положительном результате выше 95 %.

При использовании станции Echo 525 с постановкой реакции в объеме 5 мкл в 384-луночном планшете для ПЦР в комбинации с прибором QuantStudio 5 чувствительность исследования была выше, чем при использовании станции дозирования с применением наконечников с постановкой реакции в объеме 25 мкл в 96-луночном планшете для ПЦР в комбинации с быстрой системой для проведения ПЦР в реальном времени 7900HT. Данный результат, по-видимому, можно объяснить использованием другого термоциклера в сочетании с лучшей теплопередачей в меньшем объеме.

Рисунок 2. Кривые амплификации для образцов из 384-луночного планшета

Рисунок 2. Кривые амплификации для образцов из 384-луночного планшета в 5 мкл с 2 образцами положительного контроля (выделены зеленым) и 1 положительным образцом (выделен желтым); отрицательные образцы или отрицательные контрольные образцы показаны синими базовыми линиями.

Сводная информация

Усиленное контрольное тестирование и раннее обнаружение передачи SARS-CoV-2 в местах, в которых вирус не был выявлен, являются ключевыми мерами по борьбе с распространением инфекции и позволяют снизить существенные нагрузки на здравоохранение, экономику и общество в связи с пандемией COVID-19 по всему миру.

Такие инструменты, как станция дозирования Echo 525, дают возможность проводить быстрые, высокопроизводительные и бюджетные анализы, например, в рамках подобных популяционных исследований, делая их менее трудоемкими и снижая объемы реагентов, а следовательно, и стоимость анализа. Кроме того, технология Echo без применения наконечников позволяет реализовывать более экологически рациональные программы тестирования и еще больше сокращать затраты благодаря уменьшению количества одноразовых наконечников, используемых в рабочем процессе. За счет уменьшения реакционного объема и увеличения скорости постановки реакции с помощью станции дозирования Echo 525 также можно повысить производительность тестирования с ~1300 образцов в день до ~5000 образцов в день.

Ключевые аспекты

До внедрения станции дозирования Echo 525 в лаборатории профессора Крисанти стандартный метод заключался в использовании станции дозирования с применением наконечников и 96-луночного планшета в сочетании с быстрой системой для проведения ПЦР в реальном времени 7900HT. Станция дозирования Echo 525 дополнила фонд приборов лаборатории и позволила оптимизировать постановку ОТ-кПЦР после экстракции с использованием 384-луночного планшета в системе для проведения ПЦР в реальном времени QuantStudio 5. 

Преимущества рабочего процесса с использованием станции Echo в лаборатории:

  • Сокращение времени ручного труда с 8 часов до 2 часов: на 75 % быстрее
  • Снижение затрат на реагенты: экономия 80 % (уменьшение объема ОТ-кПЦР с 25 мкл до 5 мкл)
  • Сокращение времени выдачи результата с 3 часов до 15 минут: дозирование реагентов на 92 % быстрее для ОТ-кПЦР
  • Снижение расхода пластиковых наконечников: Повышение рациональности и исключение проблем, возникающих с поставкой наконечников
  • Не требуется частое техническое обслуживание: Пользователям не нужно выполнять калибровку жидкости или техническое обслуживание, отнимающее много времени.
  • Простота в использовании: Платформа и программное обеспечение Echo просты и удобны в использовании.
  • Требуется меньше термоциклеров: За счет перехода с 96-луночных на 384-луночные планшеты необходимо меньшее число термоциклеров, что также является преимуществом из-за высокого спроса на 96-луночные устройства в условиях пандемии.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить профессора Крисанти и его группу, в особенности Элизу Франчин и Клаудию Дель Веккьо, за их огромную помощь в предоставлении результатов своей работы.

Лаборатория

Рисунок 3. Сотрудники лаборатории в составе группы профессора Крисанти в Университете Падуи в Италии

Ссылки

  1. Всемирная организация здоровья (ВОЗ). Novel Coronavirus (COVID-19) Situation. https://covid19.who.int (2020)
  2. Crisanti. A. et al. Suppression of COVID-19 outbreak in the municipality of Vò, Italy. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.20053157v1
  3. Corman. V.M. et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance Vol. 25 doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045 (2020)

© 2020 Beckman Coulter, Inc. Все права защищены. Наименование Beckman Coulter, стилизованный логотип, а также знаки продукции и обслуживания Beckman Coulter, упомянутые в настоящем документе, являются товарными знаками или зарегистрированными товарными знаками компании Beckman Coulter, Inc. в США и других странах. Echo является товарным знаком или зарегистрированным товарным знаком компании Labcyte Inc. в США и других странах. Все прочие названия продуктов и торговые марки являются собственностью соответствующих владельцев.

Изделия Biomek i-Series и Echo предназначены только для исследовательских целей. Они не предназначены и не валидированы для применения при диагностике заболеваний или других состояний.

AAG-803110.20

Заполните форму ниже, чтобы связаться с нами