AUC в 1980-1990-е годы: преодолевая трение

Сила трения – это сила, возникающая при контакте двух поверхностей и скольжению одной из них по другой. Величина силы трения зависит от характеристик поверхности, а также угла, места приложения и величины силы, которая прижимает одну поверхность к другой.

Несмотря на признанную полезность для исследовательского сообщества и постоянную поддержку авторитетных ученых, таких на Говард Шачмен из Калифорнийского университета в Беркли, к началу 1980-х годов слава AUC пошла на спад.

Потерю интереса усугубляли три "силы трения".

Во-первых, все более твердым становилось убеждение, что AUC слишком сложно для использования в большинстве обычных экспериментов и представляет ценность только в случае высокоочищенных систем и для исследователей, стремящихся к глубокому химическому анализу растворов.16

В следствие этого многие биохимики и молекулярные биологи начали определять молекулярные массы более простыми и дешевыми методами, такими как гель-проникающая хроматография и гель-элетрофорез. Помимо этого, большее внимание начали привлекать кристаллография и ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Про AUC вспоминали все реже.9 В 1980-х гг. была не редкостью ситуация, когда в опубликованном учебнике даже не упоминалось об аналитическом ультрацентрифугировании.

Сторонники метода утверждали, что AUC выполнять проще, чем другие стандартные методы молекулярной биологии, и приводили примеры исчерпывающих, легко понятных данных о молекулах в растворе, которые можно получить даже без детального количественного анализа. Неожиданно быстрое или медленное образование границы при AUC могло, например, помочь интерпретировать путанные результаты, полученные другими экспериментальными методами.16

Вторая "сила трения" тесно связана с первой. Несмотря на двадцатилетние революционные труды Фудзиты, анализ огромных массивов данных, генерируемых при AUС, по-прежнему представлял собой сложную и трудоемкую задачу. Определение коэффициентов седиментации, трансляционной диффузии, трения, а также плавучей массы, исходя из данных о скорости седиментации, было затруднено, в особенности в случае сложных смесей. Простых решений уравнения Ламма тогда еще не существовало.16

Ну и наконец общий интерес к биофизической химии биополимеров начал ослабевать в пользу новых разработок в области молекулярной биологии и рекомбинантной технологии.11

Казалось, что время бума, достигшего максимума в 1950-1970-е годы, подходит к концу.

Все возвращается на круги своя

Beckman XL-A

Beckman XL-A Analytical Ultracentrifuge

В реальности, потребовалось не так много времени для понимания того, что аналитическую ультрацентрифугу не постигнет та же участь, что и дисковый телефон или восьмидорожечный магнитофон.

К середине 1980-х годов стало очевидно, что ЯМР (в режиме высокого разрешения) и кристаллографию можно применять только для ограниченного набора биологических макромолекул. Также выяснилось, что значения молекулярных масс, полученные методами гель-хроматографии и гель-электрофореза, намного менее точны по сравнению с результатами AUC. А точность оценки этого параметра критична для определения субъединиц комплекса макромолекул.9

По иронии судьбы, к 1990-м годам некоторые из достижений молекулярной биологии и биотехнологии, которые практически вычеркнули AUC из истории науки (например, исследования биотерапевтических белков), потребовали очень точного понимания физического взаимодействия биополимеров и наночастиц.

В результате интерес к AUC снова начал расти.

Возрождению AUC в значительной степени способствовало появление в 1992 году принципиально новой аналитической ультрацентрифуги XL-A от Beckman Instruments. В настоящее время ее выпускает Beckman Coulter Life Sciences под названием ProteomeLab XL-A.

Новый инструмент не уступал в аналитической мощности Spinco Model E, но по конструкции напоминала Model L. XL-A была компактной и простой в эксплуатации. И в отличие от предыдущих моделей, задание скорости вращения ротора, температуры и сбор данных осуществлялись с помощью компьютера.

Теперь эксперименты, длившиеся от нескольких часов до нескольких дней, могли выполняться с минимальным участием оператора, а данные можно было просматривать и анализировать в режиме реального времени по мере продвижения вперед.12

Еще Говард Шачмен рекомендовал Эду Пикельсу из Spinco усовершенствовать инструмент. Новый XL-A имел абсорбционную оптическую систему и сканирующий монохроматор, что позволяло измерять концентрацию образца при длинах волн от 190 до 800 нм.

Интерференционная оптика Рэлея будет добавлена позже, к аналитической ультрацентрифуге ProteomeLab XL-A. В результате получится инструмент ProteomeLab XL-I, способный записывать данные двух оптических систем одновременно.

Уже десятилетия назад Шачмен и Пикельс знали недостатки и преимущества каждой оптической системы. Абсорбционная оптика весьма полезна в экспериментах с нуклеиновыми кислотами и для обнаружения любых макромолекул, содержащих сильные хромофоры.

В противоположность этому, интерференционные оптические системы больше подходят для анализа макромолекул без сильных хромофоров (например, полисахаридов), а также образцов, содержащих сильно абсорбирующие буферные компоненты. Их также используют для характеризации образцов с высокой концентрацией.

Независимо от используемой оптической системы ультрацентрифуги XL-A и XL-I стали чрезвычайно важным этапом в истории развития AUC.

В 1960-х годах измерение молекулярных масс и характеризация моделей ассоциации даже простых самоассоциирующихся белков могли занимать несколько недель, в том числе в отлично оборудованных лабораториях. Теперь такие измерения могли выполняться на регулярной основе за несколько дней.

Поэтому AUC не только не устарело, но и стало в 1990-х годах популярным методом для определения расширяющегося спектра свойств макромолекул в растворе, таких как:

  • Размер
  • Распределение по размерам
  • Чистота
  • Первоначальная конформация
  • Термодинамическая неидеальность (включая вириальные коэффициенты и коэффициенты активности)
  • Константы равновесия самоассоциации
  • Связывание с лигандами и другими макромолекулами
  • Механизмы самоассоциации
  • Характеризация структуры гелей и комплексов макромолекул

Технология, изобретенная Теодором Сведбергом в 1920-х гг., усовершенствованная Бимсом и Пикельсом в 1940-х гг. и купленная дальновидным Арнольдом Бекманом в 1950-х гг., вновь стала серьезным помощником ученых в области life sciences по всему миру.

Ну, почти серьезным.

Как-то давний обожатель AUC Говард Шачмен, будучи уже уважаемым исследователем-биохимиком и профессором аспирантуры Калифорнийского университета в Беркли, предложил интересный способ продемонстрировать, что ему удалось узнать с помощью AUC о стабильности димеров и тримеров.

Обладавший особым чувством юмора Шачмен, придумал с этой целью шутливые «модели обезьян», которые стали популярны в литературе того времени и о которых он часто рассказывал на своих лекциях в Обществе Харви Рокфеллеровского университета.14

Однако следующий важный шаг в развитии AUC сделала не одна из обезьян Шачмена.

Это сделал Ламм.

9 Harding SE. Analytical Ultracentrifugation and the genetic engineering of macromolecules. Biotechnol Genet Eng Rev 1993;11:317-356.
12 Cole JL, Hansen JC. Analytical Ultracentrifugation as a contemporary biomolecular research tool. Journ Biomolec Tech 1999;10:163–176.
14 Howard Schachman, “University of California Professor of Molecular Biology: Discussions of His Research Over His Scientific Career From the 1940s Until 2010,” conducted by Sondra Schlesinger between 2007 and 2010, Regional Oral History Office, The Bancroft Library, University of California, Berkeley, 2010.
16 Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.