AUC в 21 веке: новые решения уравнения Ламма

В начале 21 века развитие AUC было связано в большей степени с математикой, чем с научной основой экспериментов по скоростной седиментации.

В то время как лавры создателя первой аналитической ультрацентрифуги достались, главным образом, шведскому ученому Теодору Сведбергу, человеком, разработавшим способ анализа данных скоростной седиментации, стал аспирант Сведберга из Гётеборга (Швеция).

Его звали Оле Альберт Ламм.

В 1929 году он вывел общее уравнение, описывающее поведение подвижной границы в поле центробежных сил ультрацентрифуги. В последующем оно получит его имя. Если говорить точнее, это уравнение описывает распределение концентрации растворенных веществ, получаемое в результате седиментации и диффузии при ультрацентрифугировании в стандартных ячейках с формой сектора.

Благодаря Ламму, анализ седиментации заключается в анализе единственного дифференциального уравнения. Но к сожалению, оно не имеет общих решений. Точное решение представляет собой бесконечный ряд интегралов, которые могут быть взяты только численными методами.

Ole Albert Lamm

С момента вывода Ламмом уравнения в 1929 году и на протяжении большей части 20-го века отсутствие точного аналитического решения затрудняло анализ скоростной седиментации (SV) и ограничивало экспериментальные возможности.4

По мере развития AUC уравнение Ламма было решено аналитически для ограниченного числа конкретных случаев такими учеными, как Хилдинг Факсен, У.Дж.Арчибальд и, в последний раз, Хироши Фудзита. Но в третьем тысячелетии мы вошли в компьютерную эру, о которой Сведберг и Ламм могли только мечтать.

Компьютеры больше не были размером с холодильники. Как и телевизоры, персональные компьютеры стали обычным явлением в любом доме по всему миру. Создание программного обеспечения, способного выполнять прямую аппроксимацию уравнения Ламма для анализа SV-данных, 15 позволило, наконец, реализовать его колоссальный потенциал.

Одной из таких программ стала программа SEDFIT, разработанная Питером Шаком с коллегами. Она позволяла быстро и строго генерировать решения уравнения Ламма для интерпретации SV-данных.16

Вместе с другими программами SEDFIT служила источником новых экспериментальных стратегий и приложений4 и позволяла обнаруживать, количественно оценивать и характеризовать примеси, присутствующие в растворах в ничтожных количествах.16

Ранние методы анализа приводили к противоречиям при работе с очень маленькими (молекулярная масса < 3 000 Да) и очень большими (молекулярная масса > 10 000 000 Да) молекулами. Внедрение новых компьютерных программ устранило эти ограничения, что позволило, например, получать полезную информацию об ассоциации маленьких пептидов, а также о гетерогенности и агрегации вирусов.

Всего несколько лет спустя некоторые новые программные решения для AUC смогли проанализировать комбинированные данные нескольких экспериментов, включая данные, собранные с использованием методов, базирующихся на основных принципах гидродинамики и термодинамики. Другие программы, опираясь на принципы термодинамики, смогли проанализировать данные равновесной седиментации (SE).17, 18

AUC в биофармацевтических исследованиях

С начала текущего столетия метод AUC доказал свою пользу для многих новых приложений и отраслей (например, для создания нанопродуктов, используемых в косметике, и биологически инертных контрастных веществ).19

Но самым важным и перспективным применением AUC можно назвать его использование в развивающейся области биофармацевтических препаратов.

В сочетании с новым аналитическим ПО AUC стало мощным инструментом, помогающим ученым-биофармацевтикам оценивать степень агрегации молекул препарата, характеризовать его гетерогенность, стабильность структур более высокого порядка, состоящих из мономерных форм, и измерять их биофизические свойства в растворе.11

Метод может не только предоставить независимую информацию о количестве и распределении по размерам агрегатов в биофармацевтическом образце, находящемся в рецептурном буфере. Поскольку AUC и эксклюзионная хроматография основаны на разных научных принципах, использование первого метода позволит избежать ограничения, которые негативно влияют на результаты в случае использования второго.

Более того, AUC позволяет получить эту информацию на ранних этапах разработки препарата, еще до того, как метод SEC становится выполним. В последствии, это обеспечит гарантию того, информация, полученная методом SEC, значима, даже если рецептурный буфер, в котором находится образец, отличается от подвижной фазы в SEC.11

Если говорить с точки зрения размера частиц, AUC более универсально, чем SEC. Его можно использовать для характеризации целого спектра биофармацевтических препаратов: от небольших до крупных белковых частиц, таких как вирусы, вирусоподобные частицы (VLPS) или наночастицы, используемые в системах доставки лекарств в рамках генной терапии.

Многие из этих революционных средств разрабатываются для лечения некоторых наиболее частых и смертельных форм рака, например, поджелудочной железы, молочной железы, толстой кишки, легких и простаты. И это только начало.

Не менее захватывающим выглядит применение AUC для разработки терапевтических средств на основе антител (области, в которой этот метод уже считается золотым стандартом), гликовакцин, терапевтических систем на основе ДНК и макромолекул для лечения всего на свете: от аллергии до ожирения. 20

В современном мире сложно переоценить важность технологии AUC.

Благодаря мощному сочетанию технической части (спасибо Сведбергу, Пикельсу, Бекману и другим) и программного обеспечения (спасибо Ламму, Фудзите, Шаку и его коллегам) AUC стало незаменимым инструментом исследования макромолекул в 21 веке.

К сожалению, Арнольд Бекман умер в 2004 году в возрасте 104 лет и смог увидеть только первые результаты такого сотрудничества инженерии и компьютерного программирования.

А Говард Шачмен стал свидетелем гораздо большего количества эволюционных изменений технологии, которой он посвятил большую часть свой рабочей деятельности и жизни. Шачмен покинул этот мир в возрасте 97 лет в 2016 году.

По случайному совпадению в этом же году компания Beckman Coulter Life Sciences представила миру свою ультрасовременную аналитическую ультрацентрифугу Optima AUC, которая без сомнения понравилась бы Шачмену.

Optima AUC: новый стандарт аналитического центрифугирования

Недавно Beckman Coulter Life Sciences способствовала возвращению AUC в гущу исследований белков и характеризации макромолекул, выпустив аналитическую центрифугу нового поколения Optima AUC.

Благодаря более высокой скорости сканирования, увеличенной точности длины волны и улучшенному разрешению данных, при каждом запуске Optima AUC дает ученым более точные ответы. При скорости вращения ротора до 60 000 об/мин скорость сбора данных на Optima AUC почти в 5 раз больше, чем на ProteomeLab XL-A / XL-I, а радиальное разрешение больше в 3 раза, поэтому Optima AUC может генерировать почти в 15 раз больше данных.

В настоящее время Optima AUC может быть оснащена абсорбционной и/или интерференционной оптической системой и иметь до трех независимых систем одновременной детекции. И в отличие от ProteomeLab XL-A / XL-I оптические системы находятся вне камеры ротора, что упрощает обслуживание Optima AUC.

Сенсорный экран 15" (38 см) отображает ход выполнения эксперимента. Возможность удаленного мониторинга позволяет исследователям настраивать инструмент, следить за центрифугированием и получать доступ к экспериментальным данным, находясь практически в любом месте.

Optima AUC совместим с ячейками, роторами и программным обеспечением, которые используются в ProteomeLab XL-A / XL-I, но превосходит предшественника по разрешению изображений и числу интерференционных полос, которые она может запечатлеть.

Мы живем в гиперподключенном мире. Поэтому неудивительно, что новая аналитическая ультрацентрифуга Optima AUC позволяет исследователям отслеживать свои эксперименты из любой точки мира, где есть доступ в Интернет.

Не подлежит сомнению, что в будущем AUC может действительно не иметь ограничений.

4 Schuck P. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: discrete species and size-distributions of macromolecules and particles. Boca Raton (FL): CRC Press; 2016.
11 Berkowitz SA, Philo JS. Characterizing biopharmaceuticals using analytical ultracentrifugation. In: Houde DJ, Berkowitz SA, editors. Biophysical characterization of proteins in developing pharmaceuticals. Waltham (MA): Elsevier; 2015.
15 Schuck P. Sedimentation analysis of noninteracting and self-associating solutes using numerical solutions to the Lamm equation. Biophys J 1998;75:1503–1512.
16 Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.
17 Johnson ML, Correia JJ, Yphantis DA, et al. Analysis of data from the analytical ultracentrifuge by nonlinear least-squares techniques. Biophys J 1981;36:575–588.
18 Vistica J, Dam J, Balbo A, et al. Sedimentation equilibrium analysis of protein interactions with global implicit mass conservation constraints and systematic noise decomposition. Anal Biochem 2004;326:234–256.
19 Kaur IP, Kakkar V, Deol PK, et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release 2014;193:51-62.