Протокол окрашивания клеточного цикла

Реагенты, приборы и программное обеспечение

  • Cell Cycle Kit (Beckman Coulter, Артикул C03551)*
  • PerFix-nc Buffer 1 (Beckman Coulter, Артикул B10825)
  • Cyclin A2-FITC
  • Фетальная телячья сыворотка (FCS)
  • Фосфатно-солевой буфер (PBS)
  • Моноклональные кроличьи антитела к фосфо-гистону H3, конъюгированные с красителем A647
  • Проточный цитометр CytoFLEX, оснащенный синим и красным лазером (Beckman Coulter)*
  • Программное обеспечение Kaluza Analysis версии 2.1 или более поздней (Beckman Coulter)*

Протокол

Фиксация образца (рекомендованная процедура)

  1. Соберите клетки.
  2. Добавьте 1x106 клеток в 5 мл пробирку.
  3. Центрифугируйте пробирку при ускорении 300 x g в течение 5 минут. Удалите супернатант.
  4. Повторно суспензируйте осадок в 50 мкл неразбавленной FCS.
  5. Добавьте 2,5 мкл PerFix-nc Buffer 1, немедленно перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 15 минут при 18 – 25 °C.
  6. Добавьте 3 мл PBS.
  7. Центрифугируйте пробирку при ускорении 300 x g в течение 5 минут. Удалите супернатант.
  8. Повторно суспензируйте осадок в 3 мл PBS.
  9. Центрифугируйте пробирку при ускорении 300 x g в течение 5 минут. Удалите супернатант.
  10. Переходите к процедуре окрашивания.

Процедура окрашивания клеток для анализа клеточного цикла

  1. Повторно суспензируйте осадок в 0,5 мл реагента Cell Cycle Kit, перемешайте пробирку на вортексе и инкубируйте в течение 15 минут в темном месте при температуре 18 – 25 °C.
  2. Образец готов к измерению на проточном цитометре (см. Измерение флуоресценции клеток на проточном цитометре).

Измерение флуоресценции клеток на проточном цитометре

  1. Настройте цитометр CytoFLEX, оснащенный синим лазером (488 нм) для измерения флуоресценции PI при помощи полосового фильтра 610/20 нм. Для многопараметрического анализа настройте цитометр CytoFLEX для измерения следующих каналов: полосовые фильтры 610/20 нм и 525/40 нм на синем лазере (488 нм) для PI и FITC соответственно и полосовой фильтр 660/10 нм на красном лазере (638 нм) для Alexa Fluor™ 647.
  2. Установите низкую (Low) скорость подачи образца для повышения точности.
  3. Добавьте двухпараметрическую гистограмму PI против времени (Time) для отслеживания стабильности подачи образца. При необходимости исключите из анализа все возмущения, с помощью гейтирования.
  4. Добавьте двухпараметрическую гистограмму PI-Area против PI-Hight, чтобы гейтировать одиночные событий. Одиночные клетки образуют диагональную область. Дуплеты будут иметь более высокий сигнал PI-Area, поскольку их пролет через луч лазера занимает больше времени.
  5. Настройте усиление на канале PI таким образом, чтобы средняя интенсивность флуоресценции пика G1 составляла 2 x 106. Таким образом пик G2/M останется в области измерения, а между пиками будет хорошее разрешение.
  6. Запишите измеряемые данные (Record).
  7. После измерения всех образцов сохраните файлы FCS и откройте или импортируйте их в программное обеспечение для последующего анализа.

*Только для научных исследований. Не для использования в клинической диагностике.