Многопараметрический анализ клеточного цикла

Метод проточной цитометрии позволяет быстро оценить стадии клеточного цикла в популяции клеток. Чаще всего, применяемые методики основываются на однопараметрическом анализе содержания ДНК в клетках. Обычно содержание ДНК определяют такими ДНК-связывающими красителями, как йодид пропидия (PI) или DAPI. Данные красители связываются с ДНК пропорционально количеству ДНК в клетке, поэтому позволяют определять 3 основные фазы клеточного цикла: G0/G1, S и G2/M. Поскольку в фазах G2 и M количество ДНК одинаково, однопараметрический подход не позволяет разделить их друг от друга. Для решения данной задачи используют многопараметрический анализ, при котором помимо окрашивания ДНК определяют экспрессию белков, связанных с различными фазами клеточного цикла, с помощью антител с флуоресцентными метками. Среди прочих, циклины, которые экспрессируются на разных стадиях цикла и гистон H3, который фосфорилируется в фазе митоза, являются подходящими мишенями для более детального изучения фаз клеточного цикла. Комбинированное измерения количества ДНК и экспрессии белков позволяет разделить фазу G2 и разные стадии митоза.

Экспрессия различных маркеров на разных стадиях клеточного цикла.
Фаза цикла Фосфо-гистон H3 Циклин A2
G2 + +
M: профаза + +
M: мета анафаза/td> +
M: поздний митоз

 

Данные многопараметрического анализа клеточного цикла 

Многопараметрический анализ клеточного цикла на клеточной линии Jurkat. Клетки Jurkat были окрашены антителами к фосфо-гистону H3-Alexa647, Циклину A2-FITC и реагентом Cell Cycle Kit. (A) Фазы G1, S, G2 Изображены в соответствии с содержанием ДНК. (B) Двухпараметрический анализ на основе содержания ДНК и окрашивания фосфо-гистона pH3 показывает различие между фазами G1, S, G2 и M. (C) Двухпараметрический анализ экспрессии pH3 и циклина A2 позволяет разделить различные стадии митоза. (D) Двухпараметрическая гистограмма, загейтированная по G2/M (Булева операция над гейтами III и IV с рисунка B). Циклин A2 и pH3 позволяет разделить клетки по стадиям G2, профаза, метафаза/анафаза и поздний митоз.